[发明专利]一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法

说明书

技术领域

一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法，属于遗传工程技术领域。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖是一种葡萄糖的衍生物，在人体内具有多种生理功能，主要作为软骨、关节处的润滑液的主要成分而对骨关节的健康起着十分重要的作用。通过补充外源的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖对于治疗中老年关节疾病，缓解关节疼痛在欧美国家已作为常用的方法而得到广泛的应用。此外，N-乙酰氨基葡萄糖还广泛应用于婴儿食品添加、化妆品和饲料添加等方面，用途十分广泛。

目前N-乙酰氨基葡萄糖的生产是通过氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应而成，其主要原料氨基葡萄糖主要是通过用盐酸或硫酸水解虾蟹外壳而生产得到。在氨基葡萄糖的生产过程中，会产生大量的含盐酸（或硫酸）乙酸的工业废水，给环境带来很大的压力。因此利用微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖成为国内外近几年研究的热点。

大肠杆菌以其培养简单，遗传操作成熟，而被用作多种发酵产品的首选宿主。微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的菌种改造通常根据大肠杆菌现有的氨基葡萄糖相关代谢途径，利用代谢工程进行修饰改造，以实现能利用简单的葡萄糖或甘油等碳源，经在大肠杆菌体内多步酶促反应，最终合成N-乙酰氨基葡萄糖。目前国内外构建N-乙酰氨基葡萄糖生产菌株一般都通过引入6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶到大肠杆菌中表达，从而将体内代谢生成的6-磷酸氨基葡萄糖合成为N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖，进而脱去磷酸根，最终形成N-乙酰氨基葡萄糖。本发明尝试通过引入不同于现有公开的技术手段的酶在大肠杆菌中表达，架构不同的代谢途径，并实现在大肠杆菌中同样高产N-乙酰氨基葡萄糖的目的。另外，现有N-乙酰氨基葡萄糖生产的大肠杆菌菌株中，为了阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物在体内的回流和降解，通过敲除大肠杆菌中nagDCABE基因簇来实现，本发明中只敲除nagABE三个基因，保留了其中的nagDC两个基因，以达到尽量避免对大肠杆菌体内基因的过多改动和敲除且能同样实现阻止N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物在体内的回流和降解的目的。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服现有技术的不足，提供一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法，该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌可通过RED重组实现基因的敲除进而达到代谢途径的阻断，通过外源基因表达架构起新的代谢途径。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：该高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌，所述大肠杆菌是通过将编码氨基葡萄糖乙酰化酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌过量表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶构建而成。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶是能催化氨基葡萄糖和乙酰辅酶A生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。

所述氨基葡萄糖乙酰化酶来源于丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum）或能表达相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙酰化酶的基因获得是根据GenBank No. AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶来源于大肠杆菌或具有相同功能酶的微生物；6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。

所述大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶包括N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白和甘露糖转运系统。

所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶由nagA基因编码，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶由nagB基因编码，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白由nagE基因编码，甘露糖转运系统由manXYZ基因簇编码。