[发明专利]一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建及应用方法有效
| 申请号： | 201410702685.4 | 申请日： | 2015-08-04 |
| 公开（公告）号： | CN104498517A | 公开（公告）日： | 2015-07-29 |
| 发明（设计）人： | 魏哲 | 申请（专利权）人： | 滨州市金朗生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/70 | 分类号： | C12N15/70;C12P19/26;C12R1/19 |
| 代理公司： | 淄博佳和专利代理事务所 37223 | 代理人： | 张雯 |
| 地址： | 256600 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 高产 乙酰 氨基 葡萄糖 大肠杆菌 构建 应用 方法 | ||
1.一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌是通过将编码氨基葡萄糖乙酰化酶基因和编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌过量表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶构建而成。
2.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述氨基葡萄糖乙酰化酶是能催化氨基葡萄糖和乙酰辅酶A生成N-乙酰氨基葡萄糖的酶。
3.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述氨基葡萄糖乙酰化酶来源于丙酮丁醇梭菌或能表达相同功能酶的微生物；所述氨基葡萄糖乙酰化酶的基因获得是根据GenBank No. AE001437.1中的CA_C0184基因序列全基因合成，或利用丙酮丁醇梭菌的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。
4.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶是能催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺生成6-磷酸氨基葡萄糖的酶。
5.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶来源于大肠杆菌或具有相同功能酶的微生物；6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的基因获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得。
6.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶包括N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白和甘露糖转运系统。
7.根据权利要求6所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述N-乙酰-6-磷酸氨基葡萄糖脱乙酰酶由nagA基因编码，6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶由nagB基因编码，N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白由nagE基因编码，甘露糖转运系统由manXYZ基因簇编码。
8.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖及其中间产物分解代谢和向胞内转运的一系列酶的基因，是通过RED重组系统实现。
9.根据权利要求1所述的一种高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体操作如下：在大肠杆菌BL21（DE3）中，敲除nagABE基因簇和manXYZ基因簇，将glmS和glmA基因分别克隆到同一表达载体上，转入敲除了nagABE和manXYZ基因簇的大肠杆菌中，即得。
10.一种权利要求1所述的高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌的应用方法，其特征在于：利用所述高产N-乙酰氨基葡萄糖大肠杆菌发酵生产N-乙酰氨基葡萄糖，以葡萄糖或甘油为碳源，酵母粉或酵母膏为有机氮源，氨水为无机氮源，通气好氧发酵而实现。
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