[发明专利]GLP-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达CHO细胞株的构建方法

说明书

技术领域

本发明利用基因工程手段，设计新颖的GLP-1与HSA的类似物。新颖的重组蛋白利用新型构建的高效表达质粒pMH₃，并在中国仓鼠细胞(CHO)中表达。获得了高活性和高表达的细胞株（CHO/pMH₃/TSXGGH）。获得的菌株产率高达9.45 μg*d^-1*10⁶cells。发酵表达产量高，纯化工艺方便，纯化所获得的产品符合原料药的要求。该药物用于糖尿病和相关疾病的治疗。

背景技术

2型糖尿病，又被称之为非胰岛素依赖糖尿病，缘于β细胞功能低下，胰岛素相对缺乏和胰岛素抵抗。近年来，2型糖尿病的患病率逐渐增加，据世界卫生组织预测，至2030年，全球将有3亿2型糖尿病患者。GLP-1药物能刺激β细胞的分化和增值，并且促进β细胞的分泌胰岛素的能力，而成为治疗2型糖尿病的关键药物。

GLP-1类似物成药的药物有Glaxo Smith Kline 公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli lily公司生产的艾塞那肽（exendin-4）。国内的长效GLP-1类似物还没有任何一个药物通过CFDA的批准上市。国外批准上市的药物有Glaxo Smith Kline 公司生产的阿必鲁泰(Albugon)和Eli lily公司生产的艾塞那肽（exendin-4），但他们在应用当中都有很明显的缺陷。阿必鲁泰因是与脂肪酸融合而变成长效药物因其制备方法而导致药物的单位活性损失100倍以上，而药物的半衰期却只有4-6 h左右，单位服用剂量大而使得患者的副作用增强。艾塞那肽是单一的蛋白药物，生物制备方法使得产品质量很好控制，但其药物的半衰期只有2 h而患者每天要注射两次，增加了患者的痛苦和副作用。

现在研究报道的人血清白蛋白与GLP-l类似物重组蛋白在酵母中表达，未考虑N末端一致性而提高药物高活性的问题。生物模拟计算和实验结果显示N末端的是GLP-1药物的活性区域，为保证N末端的一致性，本发明在新颖重组蛋白的N末端前添加His-tag标签，并在His-tag标签后加入蛋白酶位点（肠激酶DDDDK）。表达的重组蛋白6*His-DDDDK-X-GGH，纯化后经肠激酶酶切获得重组蛋白（fusion protein）。获得的重组蛋白的N末端一致，且活性高。

发明内容

本发明设计了一种重组蛋白并在中国仓鼠卵巢细胞（chinese hamster ovary, CHO）中制备方法，保证了N末端的一致性并且获得了高活性的药物蛋白。主要包含的发明内容包括以下几点。

（1）新颖GLP-1类似物的重组蛋白设计。GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA蛋白分别简写为GGH，设计XGGH蛋白（X代表一个氨基酸或无）。为表达N端一致性的目标蛋白，在蛋白的N端添加His-tag等生物标签（简称T），并在生物标签后加入肠激酶DDDDK等蛋白酶酶切位点（简称S）。通过基因工程手段获得TSXGGH的基因片段。附图中SEQ ID NO:1 GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA基因序列，SEQ ID NO:2 GLP-1(A2G)- GLP-1(A2G)-HSA蛋白序列。其它GLP-1类似物序列以此类推。

（2）高效表达质粒（pMH₃/TSXGGH）的构建。利用自行构建的高启动活性，高GC序列和poly A序列的质粒pMH₃（国际专利号：WO/2008/091276）。表达的重组蛋白为T（亲和标签）-S(蛋白酶位点)-X-GLP-1m-GLP-1m-HSA，将表达的重组蛋白简称TSXGGH。经EcoRⅠ和NotⅠ酶切PCR扩增产物并与pMH₃载体连接。构建表达细胞表达质粒pMH₃/TSXGGH。

（3）稳定表达CHO细胞株的筛选。所用的CHO细胞的贴壁培养基（D001）和悬浮培养基（B001）均为优化后的培养基。构建好的质粒经无内毒素试剂盒提取质粒后，经电转和梯度压力筛选获得表达菌株。重复低密度铺板和表型筛选四个循环后获得稳定且高表达的细胞株。稳定细胞株可以连续培养20代以上，表达量无明显变化。

（4）稳定表达CHO细胞株的悬浮驯化与发酵。筛选的8株稳定表达的细胞株，在B001中连续培养培养2个月，使得CHO细胞适应悬浮培养。按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 L生物反应器中发酵培养连续发酵12 d。蛋白产率达4.58-9.43μg*d^-1*10⁶cells。