[发明专利]GLP-1与人血清白蛋白重组蛋白的设计及稳定表达CHO细胞株的构建方法

权利要求书

1.一种GLP-1类似物蛋白质的设计方法，其特征为：蛋白序列结构为T-S-X-GGH；其中T代表的蛋白序列为生物亲和标签；S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点；X代表一个氨基酸；G代表GLP-1类似物蛋白；H代表人血清白蛋白。

2.如权利要求1所述的设计方法，其特征为：T代表的蛋白序列为亲和标签蛋白序列，优先为His-tag、His-flag、GST-tag、MBP-tag、Strep-tag中的一种，但不仅局限于所列举的亲和蛋白标签。

3.如权利要求1所述的设计方法，其特征为：S代表的蛋白序列为蛋白酶酶切位点的蛋白序列，优先为肠激酶酶切位点DDDDK、凝血酶酶切位点LVPRGS、凝血因子Xa即IE/DGR、烟草蚀纹病毒蛋白酶ENLYFQ中的一种，但不仅局限于所列举的蛋白酶酶切位点。

4. 如权利要求1所述的设计方法，其特征为：X代表的氨基酸为Gly、Pro、Arg、Val、Phe、Trp、Met、Lys、Ala和Tyr中的一种；优先选择Gly、Pro、Lys、Ala中的一种。

5. 如权利要求1所述的方法，其特征为，所设计的重组蛋白包含序列为以下的任何一种：T-S-GGH， T-S-X-GGH，X-GGH和GGH；T-S-GGH是T-S与GGH直接融合的蛋白，T-S-X-GGH为T-S，X和GGH按照权利1顺序融合的蛋白，X-GGH为X与GGH直接融合的蛋白，GGH为GLP-1类似物蛋白的二联体与人血清白蛋白的融合蛋白。

6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所设计的重组蛋白在中国仓鼠卵巢细胞CHO中进行表达，优选在CHO-S细胞中悬浮培养表达。

7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，由高效表达质粒pMH₃整合到CHO基因组中进行表达。

8. 如权利要求6所述的方法，其特征为：培养表达的培养基为优化后高效表达的培养基，CHO细胞的贴壁培养基为D001，悬浮培养基为B001，流加培养基为F001；按照1:3比例放大培养悬浮细胞，最后在10 L生物反应器中连续发酵12 d，蛋白产率高达4.58-9.43μg*d^-1*10⁶cells；发酵表达获得的重组蛋白，先通过Blue亲和柱Ni层析，再经脱盐柱置换缓冲液，再通过肠激酶剪切后获得N端均一的重组蛋白。

9. 如权利8所述的方法，其特征在于：制备获得的重组蛋白可用于2型糖尿病和通过降低血浆葡萄糖而受益的其它疾病的治疗；可用于诱导细胞分化为β胰腺细胞的1型糖尿病的治疗；可用于刺激神经系统产生饱腹感和抑制胃蠕动而受益的其他疾病。