[发明专利]一种辅酶再生与树脂原位萃取促进Colletotrichum lini ST-1对DHEA的羟化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略，提高亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1转化去氢表雄酮（DHEA）为7α,15α-羟基-去氢表雄酮(7α,15α-diOH-DHEA)转化率的方法。

背景技术

去氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一种C19肾上腺甾类化合物，主要具有抗癌、延缓衰老及免疫调节等作用。其作为甾体药物前体，在治疗绝经期综合症、硬皮病、冠心病、痛风、艾滋病等方面已作了广泛的研究并取得了一定的进展。近些年来，国内外研究者对去氢表雄酮的生物转化作用进行了广泛深入的研究。研究表明Colletotrichum lini、Mucorracemosus、Fusarium moniliforme等菌株能将DHEA进一步羟化为7α-OH-DHEA和7α,15α-diOH-DHEA。其中，羟化产物7α,15α-diOH-DHEA，是一种重要的甾体药物中间体，可用于合成多种甾体激素类药物，如合成“第四代”口服避孕药的主成分屈罗酮。由于7α,15α-diOH-DHEA具有重要药理作用和药用价值，其市场前景相当可观，因此如何提高DHEA的双羟化产率成为当前甾体药物领域研究的一大热点。

目前，能将DHEA一步转化为7α,15α-diOH-DHEA的菌株中以Colletotrichum lini活性最高，其在底物投料浓度为10 g/L的条件下，产物的摩尔转化率能达到30%左右。DHEA的生物转化具有甾体生物转化本质问题，如菌株转化活性不高、底物投料浓度低和生物相容性差、P450酶表达量不高等。针对这一现状，近些年来国内外大部分的研究都集中在筛选新型菌株或改造已有菌株，建立新型转化体系以及改善P450的表达量或提高P450的活性。这些研究都在一定程度上对DHEA的转化有正影响，但对DHEA转化为7α,15α-diOH-DHEA的转化率提高幅度不大。鉴于甾体生物转化的机制是底物在P450酶、NADPH-P450还原酶和O₂的参与下，在底物分子中加入一个O原子形成羟基，因此推测转化过程中提供还原动力的NADPH的再生也是不可忽略的一部分。同时，为了提高底物投料浓度，如何有效抑制产物的进一步降解也是亟待解决的难题。本专利为解决辅酶的循环再生以及底物投料浓度问题，建立了一种辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的策略，显著的提高了底物投料浓度和DHEA的转化率，为7α,15α-diOH-DHEA的工业化奠定了基础。

发明内容 

本发明的目的在于提供一种辅酶再生与树脂原位萃取“二合一”的方法，通过添加适量的辅底物进行NADPH再生，同时加入适量大孔吸附树脂抑制产物降解，最终实现DHEA转化过程中高底物投料浓度、高产物得率的要求。

应用上述方法转化DHEA生产7α,15α-diOH-DHEA的方法，其步骤如下：

（1）采用保藏号为CGMCC No.6501的亚麻刺盘孢霉（Colletotrichum lini）ST-1为生产菌种，25-40℃，120-220 r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；

（2）制备C. lini ST-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤（1）的PDA固体培养基上的C. lini菌株一环，接种于已灭菌的装有20-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以120-220 r/min的转速培养12-16 h至对数生长中期，即得到C. lini ST-1菌株的细胞液体培养物；

（3）发酵培养：将步骤（2）中制备好的细胞液体培养物以8-10%（v/v）的接种量接入发酵培养基，装液量为250 mL锥形瓶中装20-50 mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。

（4）辅酶再生：将步骤（3）中培养好的发酵液加入20 mM烟酸和10-15 g/L的糖（葡萄糖、果糖或蔗糖）为辅底物，通过烟酸和糖类物质的代谢进行NADPH再生。

（5）生物转化：称取适量粉末状底物DHEA，投入步骤（3）中培养好的发酵液，使其终浓度为10-15 g/L，在转化温度28℃，200-220 r/min的转速下转化24-36 h，即得初转化液。