[发明专利]一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法

说明书

本发明涉及一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法，属于生物学分析技术领域。为了解决现有技术中只能对鲜样进行分析的问题,提供一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法，该处理方法包括细胞核提取、染色和分析，所述细胞核提取所用细胞核提取液的组分为：Tris：12～18mM；Na₂EDTA：1～3mM；盐酸精胺：0.2～0.3mM；KCl：70～90mM,NaCl：10～25mM；β‑巯基乙醇：10～20mM；Triton X‑100：0.2％～0.5％；pH值为6.5～7.0。具有防止细胞核DNA降解和提高稳定性及不易被氧化，且能够适用于各种不同的植物干燥组织，提高了适用范围。

技术领域

本发明涉及一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法，属于生物学分析技术领域。

背景技术

流式细胞术(flow cytometry)是一种利用流式细胞仪对处在液流中的单个细胞或其它生物颗粒等进行快速定量分析和分选的技术。在植物学研究中，则可用于植物倍性鉴定、细胞核DNA数量测定、生殖途径鉴定等。

目前，常规的流式细胞术分析植物染色体倍性均采用新鲜植物的根尖、叶片或细嫩的组织，是因为其可以避免老组织内含有较高浓度的淀粉、多糖和其他代谢物，而这些物质分布在细胞质中，使得细胞质紧密地和细胞核粘在一起，影响了细胞核的纯度，同时，也加速了细胞核的老化，增加样品的粘度，使得其不能准确地检测出待测样品的倍性。但是，另一方面，如果采用新鲜或幼嫩的组织，就要求植物材料在短时间内要完成测定，否则细胞核DNA会发生降解，同样会影响检测的准确性。这样就限制了从野外采集的植物样品不能进行流式细胞术分析，极大的限制了流式细胞术在植物生态学、种群生物学、植物系统学中的应用。如中国专利申请(公开号：CN102243150A)公开了一种适用于流式细胞分析的果树成熟叶片的细胞核提取方法，通过对细胞核提取液的组分进行改进，所述细胞核提取液组分为：

15-20mmol/L Tris，40-60mmol/L的KCl，10-20mmol/L的NaCl，2-5mmol/L的Na₂EDTA，10-20mmol/L MgSO₄，40-50mmol/L蔗糖和0.5-1.0％Triton X-100，体积加ddH2O至200ml，调pH为7.5-8后，加入200μl的15mmol/L巯基乙醇。通过加入蔗糖使有利于维持细胞核的完整性并防止它们聚集，并通过提高Triton-X-100的处理浓度到1.0％，促使细胞质分散并选择性的溶解叶绿体膜，使有利于在核膜上打孔，以便于荧光染料顺利进入。虽然，现有技术中有提及到成熟叶片的处理方法，但是现有技术中仍然没有涉及到处理检测干燥植物组织的方法，且由于干燥植物组织是经过脱水处理，植物细胞组织基本上与细胞核粘着在一起，很难分离，且脱水后的植物细胞膜很难破壁，很难提取细胞核和保证染色效果，从而影响流式细胞分析的准确性；另一方面，由于干燥植物组织贮存时间久，细胞核内的DNA存在易断裂和降解的问题。

发明内容

本发明针对以上现有技术中存在的问题，提供一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法，本发明所要解决的问题是如何实现分析植物干燥组织，提高流式细胞分析的适用范围。

本发明的目的是通过以下技术方案得以实现的，一种适用于流式细胞分析植物干燥组织的处理方法，该处理方法包括细胞核提取、染色和分析，所述细胞核提取所用细胞核提取液的组分为：

Tris：12mM～18mM；Na₂EDTA：1mM～3mM；盐酸精胺：0.2mM～0.3mM；KCl：70mM～90mM,NaCl：10mM～25mM；β-巯基乙醇：10mM～20mM；Triton X-100：0.2％(vol/vol)～0.5％(vol/vol)；pH值为6.5～7.0。