[发明专利]利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种饲养层(Feeder)细胞的制备方法，具体涉及一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法，属于体外细胞培养技术领域。

背景技术

诱导型多潜能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）很多特性与胚胎干细胞极为相似，能分化为几乎所有的成体细胞，由于其可通过细胞重编程技术从终末分化的成体细胞得到，因此可获得患者特异性或疾病特异性的iPSCs，促使其成为研究疾病发生机制、个体化药物治疗、药物筛选和细胞治疗的热点，进一步拉近了干细胞和临床疾病治疗的距离。iPSCs在长期培养过程中容易发生分化和核型不稳定情况，在长期培养过程中维持iPSCs正常不分化状态和自我更新能力是一项极具挑战性的工作。而长期培养在饲养层体系中是维持iPSCs不分化状态和核型稳定最简单、直接和有效的方法，因此制备高质量的Feeder成为培养iPSCs的关键技术。

目前，Feeder制备方法主要有γ-射线照射法和丝裂霉素（Mitomycin C，MMC）处理法：γ射线法的优点是可大批量处理细胞，但是由于γ射线存在放射性污染及储存监管程序繁琐，费用昂贵等缺点，世界上很多地区已找不到放射源，因此多数实验研究仍采用MMC法来制备Feeder。小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs），是最常用的Feeder细胞来源；而CF-1 MEFs是培养人iPSCs（hiPSCs）最常用的Feeder细胞来源，具有增殖能力极强、可覆层生长、密度依赖性高、低密度时易发生老化等特点。

传统MMC法制备CF-1 MEF Feeder时，通常需要将MEFs以较低密度铺至细胞培养皿/瓶中，待其长至≤100%融合（保证细胞为单层存在）时，用MMC抑制其有丝分裂，存在以下问题：1)产量低，成本高：利用传统方法单个细胞培养皿/瓶处理的细胞数量较少，要想得到足够数量的Feeder就需要消耗大量的实验耗材，多批量处理必然产生昂贵的费用； 2）细胞增殖抑制不充分：若提高单个细胞培养皿/瓶处理细胞的密度，会出现细胞增殖不能被充分抑制的问题；3) MEFs的生物学行为易受影响：由于CF-1 MEFs低密度时易发生老化，分泌hiPSCs必需营养因子的能力就会下降，可能影响到hiPSCs的生长状态；4）处理时间受限：为了充分抑制细胞增殖，最好在细胞生长至80%~90%融合时用MMC处理，但CF-1 MEFs增殖速度很快，易出现覆层生长从而错过最佳处理时机。为了降低Feeder的制备成本，提高细胞处理效率，降低操作者工作强度，急需一种新方法，既可以单批处理大量细胞，又能保证细胞增殖被充分抑制。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，搅拌锤可在电磁场作用下不断旋转，使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触，可提高MMC抑制细胞增殖的效率，缩短处理时间；悬浮状态下处理细胞，回收细胞时无需消化液消化，可减少消化对细胞带来的损伤，最大限度地保持细胞的良好状态；细胞培养瓶的容积是普通培养瓶/皿的几倍甚至上百倍，短时间内可处理大量细胞，可提高Feeder的制备效率，降低Feeder的制备成本，操作更为灵活方便。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1 MEFs原代获取、CF-1 MEFs传代培养和CF-1 MEF Feeder制备等三个步骤，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，具体包括以下步骤：

（1）CF-1 MEFs原代(P0)获取：

I、取孕12.5天的CF-1小鼠，脱颈处死、无菌条件下取出胚胎，用10ml PBS（即磷酸盐缓冲液）清洗后放于无菌培养皿中；去除胚胎头部和内脏，用10ml PBS 清洗2次；

II、将剩余组织移至新的无菌培养皿中，用无菌剪刀将组织剪碎，每个胚胎加入1ml消化液，同时吹打数次，放入培养箱中消化5min；加入与消化液等体积的培养液终止消化后充分吹打尽量分散为单细胞；

III、将上述细胞悬液混匀后，每个T75培养瓶添加2个胚胎的细胞悬液和13ml培养液，然后将培养瓶放到培养箱中培养，培养瓶上注明细胞名称、代次P0及日期。

（2）CF-1 MEFs传代培养：