[发明专利]利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备饲养层细胞的方法

权利要求书

1.一种利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，包括CF-1 MEFs原代获取、CF-1 MEFs传代培养和CF-1 MEF Feeder制备三个步骤，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder时以搅拌式细胞培养转瓶机作为细胞处理设备，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋转，从而使细胞在悬浮状态下与培养液中的MMC充分接触；悬浮状态处理细胞，回收细胞时无需消化液处理，减少消化对细胞带来的损伤。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，转瓶机的旋转锤在电磁场作用下不断旋转，其旋转速度为10~20转/分钟，连续旋转0.5~2小时。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，回收细胞无需消化液处理指的是，在悬浮状态下处理细胞，处理结束后，细胞可直接离心后吸弃上清液，然后用PBS重悬细胞沉淀后清洗，不经过消化液消化过程。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，制备CF-1 MEF Feeder的具体步骤为：

A：将搅拌式细胞培养转瓶机的磁力搅拌器消毒后置于培养箱内，磁力搅拌器通过控制线与培养箱外的控制箱相连；转瓶机的专用细胞培养瓶和搅拌锤高温、高压灭菌后冷却至室温待用；

B、CF-1 MEFs培养至第3代第4天后，加入2ml消化液于培养箱中消化3分钟，用手轻拍培养瓶侧壁使细胞脱落，然后用2ml培养液终止消化，将细胞收集到同一个离心管中后计数；

C、将步骤B中收集的细胞转移到专用细胞培养瓶中，依据细胞数添加培养液至25~1000ml，将细胞密度调整至0.5×10⁶~1.3×10⁶个/ml；然后避光条件下将MMC加至上述培养液中，将MMC浓度调整至10μg/ml，充分混匀后旋紧瓶盖；

D、立即将专用细胞培养瓶置于培养箱内的磁力搅拌器上，旋松瓶盖，将控制箱上转动模式设置为10~20转/分钟，连续旋转0.5~2小时；

E、旋转结束后，立即将细胞转移至50ml离心管内，放入离心机中以1000转/分钟的速度离心5~15分钟，离心结束后，吸弃离心管中上清液，去除含MMC的培养液；

    F、用PBS重悬细胞，将细胞密度调整到2×10⁵~5×10⁵个/ml，以 1000转/分钟离心5~15分钟，离心结束后，吸弃上清液；

G、按步骤F所述方法重复3次，得到所需要的细胞，细胞计数后，冻存备用。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤A中所述的搅拌式细胞培养转瓶机，为Cell Spin 比欧细胞培养转瓶机-搅拌式-4瓶位。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤C中细胞密度调整为0.6×10⁶~1×10⁶个/ml；步骤F中细胞密度调整为3×10⁵~4×10⁵个/ml。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤D中控制箱上转动模式设置为15转/分钟，连续旋转0.5~1.5小时；步骤E和F中，离心机以1000转/分钟的速度离心10分钟。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤G中，冻存液各组分体积比为培养液:胎牛血清:二甲基亚砜=9:10:1。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养液为：以高糖DMEM培养液为基本培养液，向基本培养液中添加体积分数为10%的胎牛血清、1%的非必需氨基酸、1%的L-谷氨酰胺，充分混匀后用0.22μm滤器过滤除菌后备用；所述的消化液为0.25%胰酶+0.02%EDTA。

10.一种权利要求1所述的利用搅拌式细胞培养转瓶机快速制备Feeder细胞的方法，其特征在于，该方法在细胞培养领域制备Feeder的应用。