[发明专利]一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂是一类新型的药物，在肿瘤、心血管等疾病的治疗中存在重要的应用前景。一些重要的抑制剂业已进入临床阶段研究。比如，SAHA和FK228已经被美国FDA批准用于CTCL的治疗，VPA也已进入临床Ⅱ/Ⅲ研究阶段。然而，要想获得更多、更为有效的新型药物，必须有更加有效的筛选方案。

在特定的结肠癌细胞中，HDAC可影响转录因子TCF4的转录活性。当采用小分子化合物抑制HDAC活性时，TCF4的转录活性明显升高，其转录活性可以通过报告基因(荧光素酶或者EGFP)加以测定。对一些已知HDAC抑制剂的分析均获得了一致的结果。此外，我们采用RNAi技术干扰HDAC基因表达(同样达到抑制HDAC活性的目的)，TCF4的转录活性也明显升高。然而，在其它细胞如食管癌细胞中则没有这个效应。因此，在这个特定的结肠癌细胞中，TCF4基因的表达可以反映出HDAC抑制剂的效应。

目前获准的专利或发表论文中，在对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选时直接采用的组蛋白去乙酰化酶基因的启动子驱动报告基因(荧光素酶)或者是采用p21基因启动子驱动报告基因来进行筛选。尽管目前已知的多数抑制剂可以激活p21基因启动子的转录，但这不是全部抑制剂均有的共同之处。因此，采用p21启动子筛选可能出现假阴性问题。另外，和p21启动子一样，采用组蛋白去乙酰化酶基因的启动子也可能不是特异的表现，存在假阳性的问题。因此，这些方法均有一定的局限，本发明将TCF4反应元件分别与荧光素酶基因(可通过法学反应测定荧光素酶基因表达强度)连接构建慢病毒报告载体，同时构建不含TCF4反应元件的对照载体。将两种报告载体通过慢病毒转移至特定的结肠癌细胞中，获得稳定表达报告基因的细胞株。在对(小分子)药物库进行筛选时，利用荧光素酶基因报告体系进行精确筛选，可获得具有抑制HDAC活性的抑制剂。

发明内容

本发明的目的就是要解决临床对组蛋白去乙酰化酶抑制剂的需求，针对现有筛选利用p21基因启动子驱动报告基因来进行筛选，存在假阴性和假阳性的可能，旨在提供一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，具有简单，高效、低成本的特点。

本发明通过以下技术方案实现：

一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂的筛选方法，包括如下步骤：

1)将质粒转染宿主细胞形成稳定细胞株；

2)将获得的细胞株种植于96孔培养板，过夜贴壁后更换培养基，并加入待测样品；

3)取出上述培养板，加入细胞裂解液，取上清液，测定药物处理前后细胞的荧光素酶基因表达强度，荧光素酶基因增强，即说明待测样品为筛选的得到的组蛋白去乙酰化酶抑制剂。

所述的质粒为7TFP质粒，包含6个串联重复TCF4转录因子；

所述的质粒转染采用慢病毒转移的方式；

所述的宿主细胞为结肠癌细胞HCT116，同时还可以为EK293细胞或SW480细胞；

所述的结肠癌细胞株可以稳定表达荧光素酶基因；

本发明所述的结肠癌细胞中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与TCF4基因表达呈负相关，即当高表达HDAC时，TCF4转录活性降低，而当HDAC活性被抑制后，TCF4转录活性显著增加。

本发明的有益效果为：

1)特异性，在特定的结肠癌细胞中，HDAC与TCF4基因表达呈负相关：即抑制HDAC后TCF4的转录活性明显上升，而对TCF4的转录活性检测可以采用其特异的反应元件来驱动报告基因来加以展示。因此，我们的筛选方案具有特异性。

2)成本低，由于阳性药物可改变荧光素酶报告基因表达强度至上百倍，因此在检测时可将十个药物分别处理细胞后合并检测，仍可以有效判断是否存在阳性药物。合并检测可以达到降低成本的目的。

附图说明

图1抑制剂对TCF4转录活性的影响；

图2嘌呤霉素筛选的细胞克隆；

图3基因组DNA中7TFP整合的PCR证实。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本发明的保护范围内。