[发明专利]在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用

说明书

本发明涉及一种在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用，属于农业生物技术领域。本发明提供了选用棉铃虫能量代谢关键酶基因——精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫方法。本发明具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体及其在沉默目的基因中的应用。所述载体是由HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK基因的dsRNA的转基因植物。通过将转基因植株与野生型植株对比显示：取食这种转基因植物可影响棉铃虫的生长发育。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域；更具体地，本发明具体涉及一种在转基因植株中表达棉铃虫Ha4K的双链RNA(dsRNA)的RNAi载体及其在沉默棉铃虫靶标基因中的应用。

背景技术

在我国，目前对棉铃虫进行喷施杀虫剂仍然是主要防治手段。高毒高残留农药的滥施，不仅导致农作物产品质量下降，棉铃虫抗药性的增加，而且已危及人们的生命安全和健康。因此，生产上迫切需要发展安全、有效、新型的策略来控制害虫种群的危害。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指进化过程中，由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱导同源mRNA高效特异性降解的现象(Fire et al.，1998)。在线虫中通过喂养表达dsRNA的细菌(Kamath et al.，2001；Timmons et al.，2001)，或从溶液中吸食dsRNA(Tabara et al.，1998)，或者通过显微注射(Fire et al.，1998)，均能触发干扰基因表达沉默，且RNAi的表型至少可以遗传2代(Grishok et al.，2000)。dsRNA作为细胞内源性基因表达调节物通过降解mRNA发挥作用，已发展成为控制有害病原物的重要工具。

近年来，利用转基因植物介导的抑制昆虫基因表达的RNAi技术迅速成为国内外研究热点。Mao等(2007)分离了棉铃虫参与棉毒素(棉酚)解毒的P450基因。用表达相应dsRNA的转基因植物喂食后，棉铃虫P450基因的表达显著降低，对棉酚的耐受性大大减弱。再用含有棉酚的饲料或棉花叶片喂食，这些棉铃虫生长缓慢，甚至死亡。Baum等(2007)使用cDNA基因文库方法从玉米根虫中筛选出290个在昆虫生命活动中发挥必要生物功能的基因作为dsRNA的候选靶标，研究结果表明最有效的是V型ATP酶(V-type ATPase)，其能够在极低的浓度(1.82ng/cm²)摄食24小时内快速引起根虫的特异RNAi沉默反应。通过对玉米进行遗传转化，获得转基因玉米，使其表达出以玉米根虫关键酶为靶标的dsRNA，结果表明，转基因玉米的根部遭受的破坏要比对照减少50％(Baum et al.，2007)。在植物中表达害虫关键功能基因的双链RNA，通过昆虫取食植物，将dsRNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制昆虫防御基因的表达，使RNA干扰抗虫植物在农业生产中的应用成为可能。

在昆虫中，那些编码重要蛋白的功能基因是RNAi很好的靶标。在植物中表达针对这些基因的双链RNA(dsRNA)，通过昆虫取食植物时，将双链RNA传递到昆虫体内，能够特异地抑制相应昆虫关键功能基因的表达，从而导致昆虫的生长和发育缺陷，甚至杀死昆虫。

本发明克隆棉铃虫能量代谢的关键酶基因----精氨酸激酶基因HaAK，以其为靶标基因，利用Gateway技术，以植物RNAi表达载体pANDAHK35为基础，构建出针对于靶标基因HaAK的植物遗传转化的RNAi载体，在农杆菌的介导下，培育出表达HaAK的dsRNA的转基因拟南芥，棉铃虫取食转基因拟南芥之后，对一龄幼虫致死率高达55％，对三龄幼虫的生长发育有明显的抑制作用，且取食转基因拟南芥后棉铃虫体内HaAK基因mRNA转录水平明显的低于对照。

发明内容

本发明的目的在于针对棉铃虫对农业作物严重的危害情况，提供选取棉铃虫能量代谢关键基因-精氨酸激酶基因HaAK为RNAi的靶标基因来防治棉铃虫。