[发明专利]在转基因植株中表达HaAK基因dsRNA的RNAi载体及其应用

权利要求书

1.一种在转基因植株中表达棉铃虫HaAK的dsRNA的RNAi载体，其特征在于：HaAK片段以正反两个方向插入植物表达载体中构建而成，其中两个HaAK基因片段之间包含一个guslinker fragment，所述的HaAK是棉铃虫的精氨酸激酶基因，其中，HaAK基因片段的正反向片段均为从棉铃虫中克隆获得的HaAK的全长cDNA序列；

所述RNAi载体的构建包括如下步骤：

(1)以克隆获得的棉铃虫HaAK基因序列为基础，设计特异性正向引物F2：5'-CACCATGGTGGACGCCGCAACAAT-3'，以R1：5'-TTACAGCGACTTCTCAATT-3'为反向引物，用PrimeSTAR HS DNA聚合酶对质粒pMD18-HaAK进行PCR扩增；

扩增反应体系为：5×Prime STAR HS DNA聚合酶0.25μL，5×Prime STAR Buffer2.5μL，dNTPs 2μL，引物F2/R 1各1μL，模板pMD18-HaAK 0.5μL，补ddH2O至25μL；

扩增条件为：94℃5min；94℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；

(2)回收扩增获得的平末端PCR产物，并将其与pENTR/D-TOPO载体进行TOPO定向克隆，获得pENTR/D-HaAK；

(3)转化大肠杆菌菌株E.coli TOP 10感受态细胞，筛选抗Kan菌落，同时进行菌液PCR鉴定和测序分析；

(4)以克隆的入门载体pENTR/D-HaAK为基础，进行LR反应，LR反应体系如下：TOPO入门载体1μL，pANDA 35HK载体质粒3μL，LR反应酶0.5μL；瞬时离心，25℃过夜，加0.5μLProteinase K，37℃10min终止反应，构建出针对于HaAK靶标基因功能区域片段的RNAi载体pANDA35HK-dsHaAK。

2.一种根据权利要求1所述的RNAi载体的应用方法，其特征在于：使用所述RNAi载体转化拟南芥，获得棉铃虫取食后能抑制其生长发育的转基因植株。