[发明专利]一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法。

背景技术

猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)引起的一系列疾病，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemie wasting syndrome，PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephrophathy syndrome，PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)。

1997年，Clark等首次分离到猪圆环病毒2型。在2008年第20届国际猪病大会上，圆环病毒病被列为当前危害养猪业发展的头号疫病。我国在2000年证实猪群中存在PCV2感染，2002年由PCV2感染的引起的PWMS在全国呈暴发流行。猪圆环病毒病造成猪只生长慢，饲料报酬低，机体免疫力下降，给养猪业造成了严重威胁和巨大经济损失。据调查，PCV2在我国的阳性率已经达到80％以上。

疫苗是预防该病的主要方法之一。目前，我国商品化的猪圆环病毒2型疫苗生产工艺普遍是将收获的病毒液直接灭活，而后加入矿物油佐剂乳化而制成。这种方法由于直接以细胞繁殖的病毒液进行成品苗的生产，因此会受到细胞破碎产物、培养基成分、血清蛋白、细胞代谢产物等杂质的影响，致使疫苗免疫动物后易发生过敏反应，发热反应等副作用，同时还会影响免疫效果，而且矿物油佐剂疫苗普遍存在注射困难，注射部位易产生肿块。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法，以解决其副反应率高、免疫效果差、注射困难以及不易吸收的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪圆环病毒2型灭活冻干疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)取猪圆环病毒2型病毒培养液进行澄清处理，得到病毒液；

2)对步骤1)得到的病毒液进行超滤浓缩；

3)使用分子筛层析柱对步骤2)浓缩后的病毒液进行纯化；

4)利用β-丙内酯对步骤3)纯化后的毒液进行灭活；

5)对步骤4)灭活后的病毒液实施冻干、制剂。

优选的，步骤1)所述澄清处理包括以下步骤：对病毒培养液先用6～10层纱布过滤，再用0.5～2μm的双层滤膜进行过滤。

优选的，步骤2)所述浓缩的倍数为20～50倍。

优选的，步骤2)所述超滤是切向流超滤，在此基础上可以对其所使用的滤膜孔径优选为30～50K。

优选的，步骤3)所述分子筛层析柱所用的层析树脂选自Sepharose 4 Fast Flow、Sepharose 6Fast Flow、Sepharose CL-2B或Sepharose CL-4B的其中一种，更优的，选择Sepharose 6Fast Flow树脂。

优选的，步骤3)利用柱层析纯化时，按柱体积的5～8％(v/v)上样。

优选的，步骤3)纯化后的病毒液中病毒效价≥10^8.5TCID₅₀/ml，总蛋白浓度≤300ug/mL。

优选的，步骤4)所述灭活包括以下步骤：取β-丙内酯稀释700～900倍，将稀释后的β-丙内酯溶液以1:(3～8)(v/v)的比例加入到步骤3)纯化后的病毒液中，灭活1～3h；在此基础上可以进一步优选为：灭活过程是在35～40℃条件下进行的。

优选的，步骤5)实施冻干时，所用冻干保护剂是由以下重量百分数的成分组成的：海藻糖1～3％；蔗糖5～8％；乳糖1～2％；聚乙烯吡咯烷酮1～5％；明胶3～6％；甘氨酸1～3％；丙氨酸0.5～1％；山梨醇1～10％；牛血清白蛋白1～2％；水余量。

制备方法可以是：

(1)按所述重量配比称取海藻糖、蔗糖、乳糖、脱脂乳溶于少量注射用水中，高压灭菌后备用；

(2)按所述重量配比称取甘氨酸溶于少量注射用水中，用0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃冻存备用；

(3)将步骤(1)、(2)制得的溶液1:1混合，加注射用水至全量即得。