[发明专利]猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，更具体是涉及到一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品。

背景技术

猪瘟(CSF)和伪狂犬病(PR)是危害集约化养猪业的两大重要传染病，在我国猪群中广泛存在，给养猪业造成巨大的经济损失。免疫接种是猪瘟和伪狂犬病防制的重要措施。目前应用猪瘟兔化弱毒疫苗和伪狂犬病活疫苗对这两种疫病的防制起了很大的作用。但猪用疫苗品种很多，在实际操作中，多针次、多剂量、多种免疫程序难以合理安排，既繁琐、费时、费力、增加成本，且容易造成漏种，直接影响预防效果。采用多联(或多价)疫苗免疫接种，以达到预防多种传染病的目的。同时，这两种疫病采取的免疫程序比较接近，这为猪瘟与伪狂犬病二联活疫苗的研制提供了可能。为了达到一次免疫可有效预防和控制CSF与PR两种疫病的发生与流行，减轻免疫接种的工作量，减少免疫次数，避免因频繁免疫所造成的免疫麻痹，相应减少了对猪群的应激。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种克服上述缺陷的猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗及其制备方法。

为达到上述目的，本发明提供一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

(1)用细胞转瓶或生物反应器培养猪瘟病毒弱毒株、伪狂犬病病毒弱毒株；

(2)分别收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液；

(3)所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按1:2-1:1.5的体积百分比混合，并在混合液中加入稳定剂和抗菌素，经冷冻真空干燥得到猪瘟、伪狂犬病细胞活疫苗。

进一步地，其中所述生物反应器为TideCell微载体生物反应器，且所述生物反应器中含有微载体，所述微载体为cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-25g/L。

进一步地，其中所述步骤(1)包括如下步骤：

(1a)制苗用细胞的传代与培养：所述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；

(1b)细胞毒种的繁殖：将所述猪瘟病毒弱毒株接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；2~3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；

(1c)制苗毒液的繁殖：

取所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤(1b)中得到的含猪瘟病毒的细胞维持液，继续培养；

取所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤(1b)中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培养。

进一步地，其中所述步骤(2)包括如下步骤：

将含猪瘟病毒的细胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后5日第一次收获换液，以后每隔4日收获换液一次，收获的毒液置于-15℃以下保存；将含伪狂犬病病毒的细胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后2~3日后收获细胞培养毒液，收获的毒液置于-20℃以下保存。

进一步地，其中所述步骤(1a)、(1b)、(1c)中的细胞培养所用的温度为36℃~37℃。

进一步地，其中所述步骤(1b)、(1c)中接种时的接种量按体积百分比计为含1%～2%生产用细胞毒种的维持液。

进一步地，其中所述步骤(1a)中的细胞生长液含90%～92％MEM液、8%～10％犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞生长液的pH值为7.0～7.2，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。

进一步地，其中所述步骤(1b)和(1c)中的细胞维持液含95%～98％MEM液、2%～5％犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞维持液的pH值为7.2～7.4，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。

进一步地，其中所述传代细胞为牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15或猪肾传代细胞IBRS-2。

进一步地，其中所述生物反应器的设定参数为：pH6.5-7.8、温度36℃~37℃、溶氧30-80%、搅拌速度30-100rpm。

进一步地，其中所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5-5个工作体积。