[发明专利]猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法及其制品

权利要求书

1.一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用细胞转瓶或生物反应器培养猪瘟病毒弱毒株、伪狂犬病病毒弱毒株；

(2)分别收获所述步骤(1)得到的细胞培养毒液；

(3)所述步骤(2)得到的两种细胞培养毒液按1:2-1:1.5的体积百分比混合，并在混合液中加入稳定剂和抗菌素，经冷冻真空干燥得到猪瘟、伪狂犬病细胞活疫苗。

2.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述生物反应器为TideCell微载体生物反应器，且所述生物反应器中含有微载体，所述微载体为cytodex系列微载体，微载体的使用密度为2-25g/L。

3.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)包括如下步骤：

(1a)制苗用细胞的传代与培养：所述传代细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液继续培养，形成传代细胞单层；

(1b)细胞毒种的繁殖：将所述猪瘟病毒弱毒株接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；每隔4～5日收获换液一次，取二收、三收细胞培养毒液作为生产用毒种；将所述伪狂犬病病毒弱毒株接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，用细胞维持液继续培养；2~3日后收获细胞培养毒液作为生产用毒种；

(1c)制苗毒液的繁殖：

取所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，弃去所述细胞生长液，接种含所述步骤(1b)中得到的含伪狂犬病病毒的细胞维持液，继续培养。

4.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)包括如下步骤：

将含猪瘟病毒的细胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后5日第一次收获换液，以后每隔4日收获换液一次，收获的毒液置于-15℃以下保存；将含伪狂犬病病毒的细胞维持液接种至传代细胞单层后培养，接毒后2~3日后收获细胞培养毒液，收获的毒液置于-20℃以下保存。

5.如权利要求3所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1a)、(1b)、(1c)中的细胞培养所用的温度为36℃~37℃。

6.如权利要求3所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1b)、(1c)中接种时的接种量按体积百分比计为含1%～2%生产用细胞毒种的维持液。

7.如权利要求3所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1a)中的细胞生长液含90%～92％MEM液、8%～10％犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞生长液的pH值为7.0～7.2，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。

8.如权利要求3所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤(1b)和(1c)中的细胞维持液含95%～98％MEM液、2%～5％犊牛血清和100~200单位/ml青链霉素，所述细胞维持液的pH值为7.2～7.4，其中MEM液和犊牛血清的单位为体积百分比。

9.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述传代细胞为牛睾丸细胞、鸡胚成纤维细胞、猪睾丸传代细胞ST、猪肾传代细胞PK15或猪肾传代细胞IBRS-2。

10.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述生物反应器的设定参数为：pH6.5-7.8、温度36℃~37℃、溶氧30-80%、搅拌速度30-100rpm。

11.如权利要求1所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗的制备方法，其特征在于，所述生物反应器的培养采用批式、流加或灌注培养的方式，灌注的速率根据细胞的密度为每天0.5-5个工作体积。

12.一种猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗，其特征在于，所述猪瘟、伪狂犬病二联活疫苗通过权利要求1-11任一所述的方法制得。