[发明专利]一步法反转录PCR检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种基于埃博拉病毒保守区间、可以对埃博拉病毒5种亚型进行检测和分型的引物、探针及试剂盒。

背景技术

埃博拉病毒病(Ebola virus disease,EVD)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的一种传染性强、死亡率极高的急性出血性、人与非人灵长类动物共患的传染病。因1976年在非洲刚果民主共和国(前扎伊尔)北部的埃博拉河(Ebola)沿岸首次暴发流行而得名。EVD的主要特征是发热迅速，头痛和肌肉疼痛，之后产生咽喉肿痛，恶心，呕吐腹泻以及腹痛，将近一半病人会出现出血症状。此病发病急，病程短，死亡率高达30％-90％，是一种烈性病毒性传染病。EVD目前呈现地方性流行，主要流行于非洲大陆，我国尚未有本病的报道。EBOV已经通过非人灵长类动物试验证实可以通过接触传播和空气传播。因此，自然界各种因素都有可能造成EVD的爆发。EVD的病原体为EBOV，在分类上属于丝状病毒科(Filoviridae)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)成员，为单股负链非节段RNA病毒。目前埃博拉病毒有5种不同的亚型：埃博拉扎伊尔型(Zaire ebolavirus)，埃博拉苏丹型(Sudan ebolavirus)，埃博拉本迪布焦型(Bundibugyo ebolavirus)，埃博拉塔伊森林型(Forest ebolavirus)，埃博拉莱斯顿型(Reston ebolavirus)。目前埃博拉病毒的常用检测方法有：

(1)电镜检测。取病人或猴的病料接种于Vero-98等细胞，37℃培养6-7天后镜检。或者，取病人或猴的病变脏器用电子显微镜直接观察病毒的形态结构。电镜检测方法需要固定、脱干、垫入、分割和染色等步骤，耗时相对较长，而且埃博拉病毒与马尔堡病毒同为丝状病毒科，具有相似的形态，容易产生误诊，同时对操作人员要求也较高。

(2)血清学检测。血清学试验多采用免疫荧光技术，另外还建立了固相间接免疫酶试验、放射免疫试验、酶联免疫吸附试验和蚀斑减少中和试验等方法。血清学检测方法的基础是抗原抗体的特异反应。如检测抗原，除了要求抗体为单抗或多抗，是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果；如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以完全做到。另外，不同埃博拉病毒亚型以及埃博拉病毒和丝状病毒科其他病毒之间存在交叉反应。因此，从某种意义上来说，血清学实验的假阳性和假阴性是不能完全避免的，从而影响了实验的准确性。

(3)分子生物学检测。此类检测方法以PCR检测为主，尤其是反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术的发展，为快速、准确地检测埃博拉病毒以及其他传染病提供了更可靠的诊断方法。RT-PCR方法可以在病毒感染的各个时期(尤其是抗体产生初期)的各种临床样品中检测到病毒核酸，这就为传染病尤其是像埃博拉病毒病这种烈性传染病的预防、诊断和控制奠定了基础。但目前为止，仍然没有一种RT-PCR方法可以同时检测和分型所有5种埃博拉病毒亚型。

发明内容

本发明的目的是提供一种高度灵敏、特异、快速检测和分型埃博拉病毒5种亚型的引物、探针及试剂盒,同时确保此系统不扩增其它非埃博拉病毒的微生物，尤其是与其相近的其他病原体，如马尔堡病毒(Marburg virus)等。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：