[发明专利]一株产甲壳素脱乙酰酶菌株及在发酵产甲壳素脱乙酰酶中的应用

说明书

技术领域

本发明公开了一株产甲壳素脱乙酰酶的菌株以及利用该菌株发酵产甲壳素脱乙酰酶的方法，属于生物技术领域。

背景技术

甲壳素(chitin)是地球上仅次于纤维素的第二大生物多糖，也是地球上唯一大量存在的天然碱性多糖，它广泛存在于昆虫的甲壳，甲壳纲动物虾蟹的甲壳，真菌(酵母、霉菌)的细胞壁以及植物的细胞壁中。每年甲壳素的生物合成量约为100多亿吨。

甲壳素是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖通过β-(1,4)糖苷键连接而成的线性聚合物，分子中存在大量的氢键，溶解性能很差。壳聚糖是甲壳素分子中的乙酰氨基部分或全部脱除后的产物，由于其分子中存在大量的自由氨基，分子带正电荷，化学性质活波，溶解性能得到很大改善，因而在国内外的应用十分广泛。如：用作污水处理剂，食品的增稠剂和防腐剂，可降解包装材料，超滤膜等；也可作为酶和细胞的固定化载体、缓释材料等。另外，壳聚糖在医药领域受到越来越多的关注，可用于制作人造皮肤，作为膳食纤维添加到保健品中，可以降血脂，促进骨骼生长等。目前壳聚糖的生产主要采用高温浓碱法，但该方法对环境污染较大，同时存在产品脱乙酰度不均匀、分子量变化大，生产成本高等问题。

甲壳素脱乙酰酶(chitin deacetylase,E.C.3.5.1.41,简称CDA)可以催化甲壳素分子中乙酰氨基的水解，将甲壳素转变为壳聚糖。用其替代现有的浓碱法生产壳聚糖，不仅可以解决目前壳聚糖生产中存在的环境问题，同时还可以得到分子量分布范围窄、乙酰化均匀等特性的高质量的壳聚糖。自1974年Araki等最初从Mucor rouxii中发现甲壳素脱乙酰酶存以来，研究者相继从多种细菌、霉菌及酿酒酵母中发现该酶的存在。但是大部分菌株所产甲壳素脱乙酰酶为胞内酶，且酶活力、产率较低，这将影响该酶在甲壳素生物转化过程中的应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种产甲壳素脱乙酰酶的 菌株Aspergillus versicolor X，同时还提供了一种利用杂色曲霉(Aspergillus versicolor)X发酵产酶的方法。

本发明实现上述目的的技术方案是：

Aspergillus versicolor X是以山东某生物制品厂甲壳素生产废弃物土壤为原材料，采用连续稀释涂布平板法筛选分离，其中以4-硝基乙酰苯胺为显色剂，后经分离纯化获得。已于2014年10月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号为CCTCC NO:M2014459，保藏地址为中国武汉武汉大学(邮编为430072)。具体筛选步骤如下：

(1)菌种的初筛及纯化

将原材料(甲壳素生产废弃物土壤)以10％(w/v)的量加入无菌生理盐水中，震荡20min，静置15min，取上清经连续稀释涂布于固体筛选培养基。培养基组成为胶体甲壳素20g/L，磷酸氢二钾0.7g/L，磷酸二氢钾0.3g/L，硫酸镁0.5g/L，氯化钠0.1g/L，4-硝基乙酰苯胺(PN)0.4g/L，琼脂20g/L。30℃恒温培养60h。

挑取固体筛选培养基中，菌落四周出现黄色的单一菌落，分别于固体筛选培养基中划线分离，连续分离至单一菌落特征一致。

(2)菌种的复筛 

将初筛得到的菌种分别接种至液体培养基中，培养基组成同初筛培养基(不添加PN，琼脂)，30℃，160rpm恒温培养72h，分离收集上清液(粗酶)测酶活。每种菌重复2瓶。从中选取产酶活力最高的菌株。

CDA活力测定：采用MBTH方法测定。在试管中加入100μl 50mM pH7.0PBS缓冲液，然后加入100μl含100μgN-乙酰氨基壳六糖的水溶液及50μl经离心分离的发酵上清液，于30℃下反应30min，加入250μl 5％KHSO₄终止反应。在反应液中加入250μl 5％NaNO₂，间断地摇动15min，再加入250μl12.5％氨基磺酸氨，5min后加入250μl 0.5％MBTH，并在沸水中加热3min，冷却后加入250μl 0.5％FeCl₃，30min后于650nm处测定吸光值。以标准氨基葡萄糖盐酸盐作标准曲线。一个酶活单位确定为：以N-乙酰氨基壳六糖为底物，每分钟产生1μg氨基葡萄糖所需要的酶量为一个单位。

(3)菌种鉴定

分子生物学鉴定委托广东省微生物分析检测中心进行。DNA序列如Seq ID No：1所示。