[发明专利]一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，可用于HIV-1感染单核巨噬细胞的体外研究。

背景技术

HIV-1感染的靶细胞包括活化的CD4+T细胞、DC、单核细胞、巨噬细胞等。其中，DC、单核细胞、巨噬细胞等髓系细胞虽然可以被感染，但是感染的比例很低，仅有不到3%的DC被HIV-1感染，且难以形成有效的复制性感染，因此这些髓系细胞被称为非允许性细胞，而CD4+T细胞则被称为允许性细胞。与CD4+T细胞一样，这些非允许性细胞也表达HIV-1感染所必需的CD4分子和辅助受体CCR5、CXCR4等，但为何HIV-1在非允许性细胞中难以形成复制性感染？这些非允许性的髓系细胞是否存在着某些限制HIV-1感染的机制？

一个偶然的发现揭开了其中的谜底。Goujon等在对DC进行基因转染时发现，用SIVsm来源的慢病毒载体比HIV-1来源的载体更容易转染成功，这引起了研究者的注意。他们进一步发现，HIV-2和SIVsm来源的Vpx蛋白能够大大促进HIV-1感染DC的数量，并能够检测到大量的全长HIV-1 DNA。这些现象提示，HIV-2和SIVsm来源的Vpx蛋白可以克服DC对HIV-1的感染限制性。那么，Vpx蛋白又是通过什么机制来克服DC的HIV-1感染限制性？ Laguette等在PMA分化的THP-1细胞中发现了一种能够与Vpx蛋白相互作用的蛋白，这种蛋白可以被Vpx降解，并且其胞内含量与HIV-1易感性成负相关。进一步研究发现，这种蛋白是一种被称为SAMHD1的酶。将SAMHD1的基因沉默后，能够使DC和THP-1解除对HIV-1感染的限制， HIV-1易感性增强12倍；对允许性细胞过表达SAMHD1，能够限制HIV-1感染，使HIV-1的感染率降低16倍。SAMHD1限制HIV-1感染的机制是通过水解胞内的dNTPs，使之低于HIV-1逆转录所需要的浓度，从而限制HIV-1的逆转录水平。

单核巨噬细胞在HIV-1感染中有不可替代的重要作用，与树突状细胞一样，是HIV-1感染过程中所接触的第一批免疫细胞，是重要的抗原递呈和免疫应答细胞，同时，其表面分子DC-SIGN还能够携带HIV-1颗粒进入细胞，逃避免疫监视，形成最初的有效感染和远端传播，是HIV-1感染的关键性细胞。但是，HIV-1在体外却难以感染单核巨噬细胞系THP-1细胞，为HIV-1感染的体外机制研究带来了困难。如上所述，SAMHD1在单核巨噬细胞系THP-1细胞的表达显著高于T细胞系SupT1和Jurkat细胞，是HIV-1难以感染THP-1细胞的主要限制因子。本发明利用从基因组中完全敲除SAMHD1基因的TALEN技术完全敲除THP-1细胞中的SAMHD1分子，构建了一种能够允许HIV-1大量感染复制的THP-1细胞模型。

发明内容

本发明的目的是针对目前缺乏可供HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞体外研究模型，提供一种以THP-1细胞系为基础的HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，该方法可用于与HIV-1体外感染单核巨噬细胞有关的研究实验。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

（1）针对SAMHD1基因的CDS1选取作用靶点，并设计1对识别序列L/R，L的序列如SEQ ID NO.11所示，R的序列如SEQ ID NO.12所示。

L：gccatgcagcgagccgat，R：tcatcgcaacggggacgc；

（2）将靶点识别单元模块的基因片段分别按照L/R序列进行串联，串联成功后克隆入pCAG-T7-TALEN(Sangamo)- Destination质粒，共构建一对TALEN表达质粒对；其中，靶点识别单元模块的基因片段按照L序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；按照R序列进行串联后对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；

（3）通过电转染法将步骤2得到的TALEN质粒对转染到对数生长期的单核巨噬细胞系THP-1细胞内；

（4）转染48小时后，将THP-1细胞在浓度为100ug/ml的新霉素中培养10-14天；筛选出活细胞，用有限稀释法对每个活细胞进行克隆化培养，得到单细胞克隆的细胞群；

（5）对上述细胞群进行基因测序，挑选出SAMHD1基因靶位点移码突变的细胞，即为HIV-1大量感染复制的单核巨噬细胞。