[发明专利]体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和医药化学领域，还涉及代谢组学，特别是 基于液相色谱质谱联用技术的代谢组学；具体的说是一种在体外利用 细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法。

背景技术

马兜铃酸(AA)是存在于马兜铃属植物中的一种重要化学成分， 含有马兜铃酸的中药主要用于治疗关节炎、痛风、风湿病以及溃脓创 伤。然而，近10年来，由于服用广防己(马兜铃属)引起严重肾毒 性的案例达100多例。研究表明，马兜铃酸是引发肾毒性的主要因素， 其机理主要是马兜铃酸与体内的DNA形成加合物，诱导A:T基因的 突变。基因突变势必会引起下游相关代谢物的变化。目前临床上还没 有统一的诊断标准，组织切片，AA-DNA加合物的检测是通常使用 的诊断方法。开发新的诊断和预测肾损伤程度的标志物势在必行。

代谢组学作为系统生物学的最下游，能够更准确的反应生物体 系的状态。在代谢组学分析的各种手段中，液相色谱质谱联用技术以 其高分离度、高通量以及普适性的优势，在众多分析方法中脱颖而出， 尤其对于非靶向代谢组学分析，其强大的定性分析能力被认为是最好 的复杂生物样品的分析技术之一。代谢组学在药物安全性评价，毒性 标志物识别方面具有广阔的应用前景.研究模型主要是动物模型，例 如，AimingLiu等应用小鼠模型分析了降脂药二甲苯庚酸诱发肝毒 性的潜在标志物。JingMa应用小型猪模型发现了半乳糖胺诱导急性 肝损伤的生物标志物。然而，应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模 型中代谢物差异的报道却相对较少。

细胞模型与动物模型相比，具有成本低、种属差异小临床转化相 对简单等优点。申请者应用人源化肾细胞研究了马兜铃酸致肾损伤进 展过程中的差异代谢物。由于生物样品的复杂性，仪器本身存在的不 稳定性及分析序列过长导致质谱响应产生一定的偏差，都会为后续的 数据建模带来困难。针对以上情况，我们采用总蛋白校正，样本概率 商归一化(PQN)及质量控制样本(QC)校正实验偏差，以保证实 验数据的可靠性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种基于超高效液相色谱质谱联用技 术利用体外细胞模型筛选马兜铃酸致肾毒性潜在标志物的方法，该方 法具有高灵敏度、高通量的优点。所筛选的潜在标志物预测性好，可 以为中药致肾毒性的临床诊断提供参考。

一种从胞内代谢轮廓筛选肾毒性发生发展过程中潜在标志物 的方法，应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模型中代谢物差异，

具体步骤如下：

(1)确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量；

(2)对正常肾细胞、马兜铃酸药物损伤肾细胞的胞内代谢物进行 分析得到胞内代谢轮廓；

(3)应用多变量统计方法分析正常细胞和马兜铃酸药物损伤细胞 的代谢轮廓数据，结合代谢物随药物作用时间的变化规律，筛选标志 物。

步骤(1)使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑 溴盐(MTT)染色法确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量， 细胞明显损伤指同等培养条件下马兜铃酸诱导损伤实验组细胞数目 与正常组细胞数目相比，具有显著性差异，P<0.5，能够导致这种明 显损伤的马兜铃酸剂量即为马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量， 采用人源化正常肾细胞HL7702作为体外研究马兜铃酸致肾毒标志物 的模型，建立了马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量的确定方法：

将悬浮于K-SFM细胞培养基中HK-2细胞等量接种于96孔板中 (104-105个/孔)。过夜贴壁后，去掉原有培养基，实验组分别加入 150ul-250ul0.3125,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80μg/ml浓度的马兜铃 酸，马兜铃酸水溶液采用K-SFM细胞培养基进行稀释。每个剂量设 计3-6个平行孔，平行设置不加药，只加等体积培养基的细胞控制组 (对照组)和不接种细胞，只加等体积培养基的空白组。培养24h-48h 后，加入15-20ul含5mg/mlMTT的磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，避光培 养3-5h,弃去培养液，加150ul-200ulDMSO，震荡300-500s,静止 10-30s,酶标仪检测496-570nm波长下的吸光度(OD)。细胞抑制率 按照以下公式计算得出：

抑制率＝(控制组吸光度-给药组吸光度)/(控制组吸光度-空白组 吸光度)×100％