[发明专利]体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方法

权利要求书

1.一种体外用细胞代谢轮廓筛选马兜铃酸致肾毒性标志物的方 法，其特征在于：应用代谢组学方法研究体外细胞损伤模型中代谢物 差异；

包括以下步骤：

(1)确定马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量；

(2)对正常肾细胞、马兜铃酸药物损伤肾细胞的胞内代谢物进行 分析得到胞内代谢轮廓；

(3)应用多变量统计方法分析正常细胞和马兜铃酸药物损伤细胞 的代谢轮廓数据，结合代谢物随药物作用时间的变化规律，筛选标志 物。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(1)使用3-(4， 5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)染色法确定马兜 铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量，细胞明显损伤指同等培养条件下 马兜铃酸诱导损伤实验组细胞数目与正常组细胞数目相比，具有显著 性差异，P<0.5，能够导致这种明显损伤的马兜铃酸剂量即为马兜铃 酸致肾细胞明显损伤的有效剂量。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)所述正常肾 细胞为人源化正常肾细胞HL7702；所述马兜铃酸药物损伤肾细胞为 采用马兜铃酸致肾细胞明显损伤的有效剂量诱导损伤的人源化正常 肾细胞HL7702，诱导损伤时间为6-24h。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(2)使用超高 效液相色谱-质谱联用技术对胞内代谢物进行分析。

5.根据权利要求1或4所述方法，其特征在于：步骤(2)所述 得到胞内代谢轮廓的过程中，采用一套细胞样本采集和处理的规范化 流程来采集、处理细胞，该流程的步骤为：

细胞刮刮取正常细胞、诱导作用时间为24h以及在0-24h中间两 个时间点的(n×4)个细胞样品分别置于离心管中，离心得细胞饼即 为所需细胞样品(每个细胞样品约10-100mg)；细胞样品重悬于 1-1.5ml甲醇的水溶液(甲醇/水，v/v，4/1-2/1)，用超声细胞破碎仪 冰上裂解细胞，得到的细胞裂解液0-4℃离心，上清液冻干复溶于 100-300ul体积分数为1/4-3/4的甲醇溶液中，得n×4个样本；对n ×4个样本依次进行超高效液相色谱-质谱联用技术分析，最终得到n ×4个样本的总离子流图，即为肾细胞内代谢轮廓谱；

其中n为每组平行试验的数量，为大于或等于6的正整数。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于：超高效液相色谱-质谱 联用技术中，色谱柱为C18柱,流动相采用体积分数为0.1％-0.2％甲酸 水溶液(A相)和乙腈(B相)，梯度洗脱，质谱采用ESI正离子模 式检测。

7.根据权利要求5所述的细胞样本采集和处理的规范化流程，其 特征在于；取细胞裂解液10-20μL，采用蛋白定量试剂盒进行总蛋 白定量，给药组与对照组样品的蛋白总量相除得出总蛋白差异系数， 给药组各色谱峰面积除以此系数将给药组细胞数目校正到对照组的 细胞数目，即可校正由于细胞数目的微小差异所造成的代谢谱强度的 差异。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)所述多变 量统计方法为偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)方法；

具体步骤为：采用R语言对样本的胞内代谢轮廓谱进行峰提取， 峰匹配，生成一个数据矩阵，数据矩阵采用偏最小二乘法-判别分析 (PLS-DA)方法进行多元统计分析，对肾细胞不同损伤程度的代谢 谱数据进行建模，根据模型中变量重要性因子筛选大于或等于1.5的 检测离子；结合这些离子在肾损伤进展过程中变化规律，进一步筛选 呈单一性变化(升高或者下降)的离子，可被认为是在马兜铃酸致肾 损伤过程中的潜在标志物。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(3)最后要对 筛选出的潜在标志物进行验证，采用感受曲线(ROC)下面积值(AUC) 对其预测准确度进行评估，AUC通常在0.5到1之间，AUC＞0.5的 情况下，AUC越接近1，说明预测准确度越好，AUC<0.5不符合真 实情况；然后对筛选出的标志物进行结构鉴定。