[发明专利]脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法。

背景技术

脂肪酶(EC3．1．1．3，Lipase)，又称甘油酯水解酶，是指分解或合成高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。脂肪酶是一类特殊的酯键水解酶，只作用于异相系统，即只在油水界面上作用，而且只有当底物以微粒、小聚合分散状态或呈乳化颗粒时，脂肪酶对底物水解才有显著的催化作用。脂肪酶广泛存在动物、植物和微生物中而微生物脂肪酶种类最多，广泛存在于细菌、酵母和霉菌中，最易获得和大规模生产，且具有比动植物脂肪酶更广的pH、温度适应性，因此是工业用脂肪酶的重要来源。

脂肪酶的生产和使用成本是制约其工业化应用的关键因素之一。由于野生菌产脂肪酶的能力低，酶系复杂，较难分离纯化，一般无法直接用于大规模生产。通过基因工程技术构建合适的表达系统不仅能够提高脂肪酶的表达量，而且可以简化后续蛋白质的分离纯化工艺，从而降低生产成本。另外，制备纯化的立体选择性酶对于立体选择性反应是非常重要的，能够避免其他非立体选择性酶的影响。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。主要优点有：（1） 具有强有力的醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；（2）作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；（3）营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产；（4）可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上； （5）表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；（6）表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；（7）糖基化程度低，所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。

长期以来，我国的脂肪酶市场都被国外公司所垄断，且价格昂贵，因此开发我国自主创新的脂肪酶及其制剂对于推动我国科技进步和实现国家繁荣富强具有重要的进步意义。国内关于脂肪酶的微生物发酵和提取技术尚不成熟，脂肪酶制剂在我国现有的酶制剂生产企业中还没有一家成规模的生产企业，其产品还存在着催化活性低、稳定性差、使用寿命短等问题。因此，积极研究开发脂肪酶及其制剂，有利于打破国外技术垄断，实现脂肪酶向产业化转变和带动相关产业的发展，实现我国的繁荣富强。

发明内容

针对我国现有技术的上述不足，本发明提供了一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，本发明的技术方案如下：

一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，其方法如下：

（1）发酵菌种

以基因工程菌毕赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作为发酵生产菌种；

（2）培养液

a、摇瓶培养液

酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，K₂HPO₄ 3g/L，H₂PO₄ 11.8g/L，加水890mL/L，121℃灭菌20 min，然后待温度降至60℃以下在超净台上加入10×YNB 100mL/L(13.4 g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4 g/L)，甘油10mL/L；

b、发酵培养液

85% H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄ ·2H₂O 0.93g /L，K₂SO4 18.2g /L，MgSO₄·2H₂O 14.9g/L，KOH 4.13 g/L，甘油40g/L，PTM₁ 4.0mL/L（其中甘油、PTM₁待实消结束后再加入）；

c、PTM₁