[发明专利]脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法

权利要求书

1.一种脂肪酶的微生物发酵及提取分离方法，其特征在于，其方法如下：

（1）发酵菌种

以基因工程菌毕赤酵母GS115 /pPIC9K-proRCL作为发酵生产菌种；

（2）培养液

a、摇瓶培养液

酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，K₂HPO₄ 3g/L，H₂PO₄ 11.8g/L，加水890mL/L，121℃灭菌20 min，然后待温度降至60℃以下在超净台上加入10×YNB 100mL/L(13.4 g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4 g/L)，甘油10mL/L；

b、发酵培养液

85% H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄ ·2H₂O 0.93g /L，K₂SO4 18.2g /L，MgSO₄·2H₂O 14.9g/L，KOH 4.13 g/L，甘油40g/L，PTM₁ 4.0mL/L（其中甘油、PTM₁待实消结束后再加入）；

c、PTM₁

CuSO₄·5H₂O 6.0g/L，KI 0.088g/L，MnSO₄·H₂O 3.0g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.2g/L，H₃BO₃ 0.02g/L，CoC1₂·6H₂O 0.5g/L，ZnCl₂ 20.0g/L，FeSO₄·7H₂O 65.0g/L，生物素0.2 g/L，浓H₂SO₄ 5 mL/L；

d、补料培养液

50%甘油(W/V，含12mL/L PTM₁)补料液；

e、BMMY培养液

酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，K₂HPO₄ 3g/L，KH₂PO₄ 11.8g/L，加水895mL/L，121℃灭菌20 min，然后待温度降至60℃以下在超净台上加入100×YNB 100mL/L(13.4 g/L)，500×生物素1mL/L(4×10^-4 g/L)，甲醇5m/L；

f、甲醇诱导培养液

100%甲醇（含12mL/L PTM₁）；

（3）菌种发酵生产

a、挑选一单菌落，置于装有25ml摇瓶培养液的250ml摇瓶中，于28-30℃/250-300 rpm培养16-18 h；

b、配制发酵培养液（甘油、PTM₁暂不加入）并加入发酵罐内，标定pH电极与DO电极并插入罐体，密封发酵罐，接通蒸汽，对发酵罐的空气系统及罐体实施灭菌，待罐压升至0.12MPa，温度121℃时，保压、保温灭菌20min，待实消结束，接通冷冻循环水将温度冷却至28-30℃；

c、在接种口周围放一圈酒精棉球，点燃，在无菌条件下打开接种口，将摇瓶培养液按5-10%接种量迅速接种于发酵罐内，并补加已经过滤除菌的甘油40g/L，PTM₁ 4.0mL/L，设定好温度、搅拌转速、通气量等参数，进行发酵，发酵20 h左右，发酵培养液中的甘油被消耗殆尽，此时DO迅速上升到100%，开始流加补料培养液，补料培养液的流加时间为6-24 h，在发酵过程中，保持罐内温度28-30℃，罐内溶氧DO>20%，罐内pH值5-7，通过调节通气量和搅拌转速来控制溶氧的高低，自动流加质量浓度25%的无菌氨水来控制发酵培养液的pH值大小；

d、待补料培养液流加结束，停止补料，维持细胞饥饿0.5-1 h，然后流加BMMY培养液0.5-1 h让酵母菌适应甲醇环境，当DO再次上升到100%时开始流加甲醇诱导培养液，控制体系中甲醇的质量浓度在0-1h内为1.0-2.0%，在2-4h内为3.0-5.0%，在4-8h内为2.0-3.0%，在8h后为0.5-1.0%，在诱导期间，温度控制在20-28℃，pH值控制在5.5-6.5，溶氧DO>20%；

e、甲醇诱导培养36-72h后，开始放罐，将发酵液转移至冷冻离心机中于4℃/1500-3000g离心5-10min，收集离心上清液；

（4）脂肪酶提取分离

a、硫酸铵沉淀

将硫酸铵粉末边搅拌边加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为2%，放于4℃冰箱静置0.5-1 h，然后于4℃/3000-5000g离心5-10min，收集离心上清液，以同样的方式再次将硫酸铵粉末加入到离心上清液中，使硫酸铵终浓度为60%，放于4℃冰箱静置0.5-1 h，然后于4℃/3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀用中性磷酸盐缓冲液溶解，得到粗酶液；

b、凝胶过滤层析

用分离分子量在16-200KD范围附近的凝胶颗粒填充层析柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将得到的粗酶液上样到层析柱上，以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到凝胶过滤粗酶液；

c、离子交换层析

用阴离子交换树脂填充离子交换柱，以中性磷酸盐缓冲液平衡离子交换柱，将凝胶过滤粗酶液上样到离子交换柱上，以去离子水冲洗离子交换柱，再以中性磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集活性峰所对应的洗脱液，将所得的洗脱液进行超滤浓缩，得到离子交换粗酶液；

d、亲和层析

用Sepharose4B填充亲和层析柱，将脂肪酶抑制剂作为配体通过共价键偶联到Sepharose4B上，以中性磷酸盐缓冲液平衡层析柱，将离子交换粗酶液上样到层析柱上，以去离子水冲洗层析柱，再以0.1M pH3-5柠檬酸缓冲液进行洗脱，收集洗脱液，将所得的洗脱液立即用弱碱性磷酸盐缓冲液中和至中性，进行超滤浓缩并除盐，得到纯酶液；

e、聚乙二醇沉淀

在得到的纯酶液中加入聚乙二醇，使脂肪酶沉淀下来，然后于4℃/3000-5000g离心5-10min，收集离心沉淀，将离心沉淀放入冷冻干燥机内干燥，得到脂肪酶冻干粉。