[发明专利]神经氨酸酶抑制剂筛选方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于酶抑制剂筛选方法，特别涉及的是神经氨酸酶抑制剂的筛选方法和应用，可以用于中药粗提物、海洋药物标准组分和小分子化合物的高通量筛选等方面。

背景技术

威胁人类健康的疾病大都被发现与相关酶的失调密切联系，因此酶是目前新药研制的重要靶标。据统计，酶抑制剂类药物约占目前整个药物市场份额的47％。对于酶抑制剂类药物的开发来讲，发现新的对靶标酶有抑制活性的酶抑制剂化合物是药物开发初期的主要任务。现在，虽然可以通过组合化学合成和天然产物提取的方式得到成千上万的化合物，但如何快速地从这数量巨大的化合物库中筛选出有活性的药物先导化合物仍然是新药开发的瓶颈。作为一种急性呼吸道传染疾病，流行性感冒（流感）一直以来都严重影响着人类的生命健康。据世界卫生组织的统计，季节性流感的流行每年都会造成300-500万例严重病例，并导致25-50万人死亡。流感世界范围的大流行更是会带来灾难性的后果。神经氨酸酶(neuraminidase，NA)是存在于病毒、菌及哺乳动物细胞中有唾液酸酶活性的糖蛋白，具有唾液酸酶活性，在甲、乙型流感病毒的复制、感染和致病过程中起重要作用；抑制流感病毒的神经氨酸酶活性，可有效地控制甲、乙型流感病毒感染引起的流感症状和疾病的传播。因此，以神经氨酸酶为靶点，筛选神经氨酸酶抑制剂，是研究和开发抗甲、乙型流感病毒药物的一个重要途径。

酶筛选模型是分子水平筛选模型中的一种，因其具有耗材量少、药物作用机制明确、筛选规模大等优点，在药物筛选领域引起人们极大的关注。在传统的以酶为靶点的抗流感病毒活性筛选方法中，大都采用在一定条件下令酶和底物反应，待反应终止后利用紫外-可见分光光度法或荧光法来检测产物，通过计算待筛样品加入前后吸收度的变化得到抑制剂的抑制率。该方法突出的优点是设备简单易于推广，但缺点是人工操作、费时不易实现高通量筛选，同时反应受外界条件变化影响大、需要酶的量较大、对复杂样品进行筛选时基体干扰最终的观测。

毛细管电泳（CE）作为继HPLC之后又一强有力的分离分析方法，具有高的分离效能和灵活多样的分离方式，有望成为药物筛选多样化的新平台。电泳中介微分析（EMMA）是在流动注射分析（FIA）和毛细管电泳（CE）基础上诞生的一项新的分析技术。该技术是将试样和试剂作为两个独立的区带先后注入毛细管内，淌度大者在后，经过一定时间的运行两者完全混合并反应，所得产物与试剂经电泳分离并流向检测器检测。因EMMA具有反应和检测的一体化、试剂消耗量为纳升级、反应分离速度快、可实现高通量、不受复杂样品基质的干扰等优点，被广泛应用于天然产物中酶激动剂、抑制剂的研究及抑制剂对酶抑制作用机理研究等诸多领域。Hamdan等建立的天然植物提取物中a-淀粉酶抑制剂的EMMA筛选方法，(I. I. Hamdan, F. U. Afifi. Saudi Pharmaceutical Journal, 2010, 18: 91-95.)首次从Geranium robertianum和Aesculus hippocastanii中发现了a-淀粉酶抑制剂。Nehmé课题组以激酶CDK5为靶点,(R. Nehmé, H. Nehmé, G. Roux, et al. Journal of Chromatography A, 2013, 1318: 257-264.)建立天然产物黄酮及其衍生产物的CE抗肿瘤活性筛选方法。赵书林课题组先后建立了天然产物中a-葡萄糖苷酶(A. Z. Zhang, F. G. Ye, J. Y. Lu, S. L. Zhao. Food Chemistry, 2013, 141: 1854-1859.)、腺苷脱氨酶(X. W. Ji, F. G. Ye, P. T. Lin, S. L. Zhao. Talanta, 2010, 82:  1170-1174.)、单胺氧化酶(K. Hu, L. C. Zhang, X. T. Li, S. L. Zhao. Journal of Chromatography B, 2010, 878: 3156-3160.)抑制剂的CE筛选方法，利用CE超强的的分离能力，对天然产物的粗提物进行筛选。最近，康经武课题组报道了天然产物中蛋白激酶抑制剂的CE筛选方法。(T. D. Wang, Q. Q. Zhang, Y. M. Zhang, J. W. Kang. Journal of Chromatography A, 2014, 1337: 188-193.)在以前的研究中，我们课题组建立了中草药粗提物中a-葡萄糖苷酶和酪氨酸酶抑制剂的CE筛选方法，(T.-F. Jiang, T.-T. Liang, Y.-H. Wang, Z.-H. Lv. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2013, 84: 36-40.  L.-P. Guo, T.-F. Jiang, Z.-H. Lv, Y.-H. Wang. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2010, 53: 1250-1253.)并利用所建立的方法研究了酶抑制剂动力学和抑制机理。从文献报道来看，目前，尚无采用EMMA技术进行神经氨酸酶活性测定和抑制剂筛选的报道。