[发明专利]一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种分子信标探针和试剂盒，通过使用荧光原位杂交的手段，检测样品中少量的无乳链球菌。

背景技术

无乳链球菌亦称B群链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，是新生儿和女性生殖系统感染的重要细菌。尤其是新生儿时期的感染，是危及生命的重要原因，其并发症包括败血症、肺炎和脑膜炎等。在成年妇女的阴道内，有15％左右可以检测出无乳链球菌，这类女性分娩的新生儿感染该菌的几率会比较高。

新生儿无乳链球菌感染分为早发性感染和晚发性感染两种。早发性感染一般是感染后一周内发病，在美国新生儿早发性感染的死亡率为4％-6％；晚发型感染多见于出生后7天～3月足月儿，主要表现为脑膜炎，常呈隐匿性发病。临床表现有发热、昏睡、颅内高压等，如伴发败血症则预后较差。多数感染都是因为母体生殖系统携带的无乳链球菌，经由破裂的胎膜进入羊水，然后感染胎儿。细菌感染呼吸道可引起肺炎，进入血液系统可引起败血症、脑膜炎和骨髓炎等。

目前临床上检测无乳链球菌最常用的方法是CAMP法：在血平板上B群链球菌能产生CAMP因子，能促进金黄葡萄球菌溶血素活性——在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直，但不要接触，二者相距3-5mm，各链球菌分离菌划线间距l0～20mm。置37℃温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。该方法具有简单、成本低的优点，缺点是灵敏度较低，且检测时间较长。样本内含菌量少时往往不能得出阳性结果，并且不能区分是无乳链球菌还是其它B群链球菌。利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率高，另一方面，患者分泌物中有往往含有抑制PCR反应的成分，这又会导致假阴性的出现，这两方面的缺点限制了PCR检测的临床应用。由此可见，无乳链球菌临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。

分子信标探针(Molecular beacon probe)，具有灵敏度高、特异性强、只有和靶序列杂交上了才会发出荧光等优点，被应用于荧光原位杂交。本发明通过对大量无乳链球菌和其它链球菌菌株的16S rRNA序列进行比对，挑选无乳链球菌的特异性序列，设计、合成分子信标探针，建立稳定的分子信标原位杂交反应体系，克服了无乳链球菌当前临床检测的诸多问题，为无乳链球菌感染的诊断、预防和控制提供新的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分子信标探针，通过荧光原位杂交的手段，建立一种快速、灵敏、特异性地检测样品中无乳链球菌的方法。

一种快速检测无乳链球菌的分子信标探针，其特征在于，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon SAG：5’-FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3’；

所述探针的5’端用FAM标记，3’端用DABCAL标记，荧光基团激发波长495nm，检测波长520nm。

进一步地，所述分子信标浓度为10ng/μL。

本发明还提供了一种快速检测无乳链球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1)裂解液：4％氢氧化钠

(2)杂交液：10％(w/v)硫酸葡聚糖，10mM NaCl，20％(v/v)甲酰胺，0.1％(w/v)焦磷酸钠，0.2％(w/v)聚乙烯基吡咯烷酮，0.2％(w/v)聚鹿糖，5mM Na2EDTA，0.1％(v/v)TritonX-100，50mM Tris/HCl(pH 7.5)，10ng/μL分子信标探针，所述分子信标探针的碱基序列为：

Beacon SAG：5’-FAM-CACCATTCTGCTCCGAAGAGAAAGCTGGTG-DABCAL-3’；

(3)终止液：1％稀硫酸

(4)洗涤液：5mM Tris，15mM NaCl，0.1％(v/v)Triton X-100，pH值为10。

本发明最后提供了一种上述试剂盒快速检测无乳链球菌的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)吸取10μL样品滴在载玻片上，自然风干；

(2)在风干的样品上加入10μL裂解液，待其自然风干后，浸入无水乙醇中，浸泡5分钟；

(3)52℃杂交10分钟；

(4)液侵泡1分钟，终止反应；

(5)滴加封片剂后，用荧光显微镜镜检，用20×物镜扫视和计数，用60或100×物镜观察细菌形态。