[发明专利]GI基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学病毒检测技术领域，具体涉及一种GI基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增法。

背景技术

浙江省是海洋大省，海产品种类及其丰富，海鲜产品深受当地民众喜爱，且很多居民有生食海鲜的习惯。海产食品，尤其是贝类，因为其滤食性的特点，成为食源性病毒如甲肝病毒、诺如病毒等的载体，有可能导致人类疾病的流行。海产品病毒的污染一般是指贝类的病毒富集污染，通常由于水体遭遇病毒污染而后经贝类富集后，将病毒传染给人类。迄今人类病毒病尚无特效药治疗，对病毒的监测成为预防和控制的有效手段。另一方面，由于近几年国外对我出口贝类频频施检诺如病毒，筑起了事实上的一道“绿色壁垒”，在很长一段时间内我们只能被动地应付国外的检查。

诺如病毒(Norovirus,Nov)归属于杯状病毒科，1972年Kapikian等人通过应用免疫电镜检测技术首次在该地区腹泻者的粪便悬液中发现了该病毒颗粒，后经证实为诺如病毒。诺如病毒是急性胃肠炎的主要病原，可以感染各年龄组的人群。根据基因组分型，该病毒分为三个不同的属：基因I组，代表株为诺如病毒；基因II组，代表株为Snow Mountain Virus(SMV)；以及札幌病毒。对多次疾病暴发流行的分析已经确认了GI基因组型(以下简称I型诺如病毒)和GII基因组型的诺如病毒是世界范围内感染人的最常见的病毒株。然而，I型诺如病毒由于其阳性样本很难取得，国内相关报道也不多，无形中增加了研究的难度。

RT-PCR技术是目前研究食品中诺如病毒检测的主要方法。但PCR法由于假阳性影响及检测成本昂贵而在应用中受到限制；同时PCR法也存在血多影响灵敏度和特异性的因素，包括被检测样品本身、病毒核酸的纯化、PCR扩增的DNA片段少于1kb不能用于全基因组扩增等。因此，有必要建立一套I型诺如病毒的检测方法，提高我国食源性疾病的检测和控制能力。

发明内容

本发明的目的是提供给一种I型诺如病毒的检测方法，从而更灵敏、特异性的来检测水产品中的I型诺如病毒。

本发明首先提供一种用于检测I型诺如病毒的引物组，包括逆转录扩增引物和锁式扩增的引物和连接片段；引物信息如下：

逆转录引物NVGI-F1：AGTTGGTACCGGAGGTTAATG(SEQ ID NO:1)

逆转录引物NVGI-R1：GGGATTAAGATGAGGGCCTAAA(SEQ ID NO:2)

另外，本发明还提供用于提高逆转录产物浓度的引物，其信息如下：

NVGI-F2：CAGTTGGTACCGGAGGTTAATG(SEQ ID NO:3)

NVGI-R2：GGGCCTAAACTCAAATCAAACAA(SEQ ID NO:4)

本发明还提供用于检测I型诺如病毒的引物和探针，其序列信息如下：

引物NVGI-RCAF：CCTCTTGCAATGGATCCTGTAG(SEQ ID NO:5)

引物NVGI-RCAR：CCAAGGGTCAATAGGGTTAACTT(SEQ ID NO:6)

连接片段NVGI-RCAP：

CAACTGCTGGGCAAGTTAACTCTGACCCTCTTGCAATGGATCCTGTAGCGGGCTCTTCAACAGCAGTTGCAACTGCTGGGCAAGTTAACCCTATTGACCCTTGGGGGCTCTTCAACAGCAGTTG(SEQ ID NO:7)。

本发明还提供一种利用上述的引物组制备的试剂盒。

本发明还提供一种利用上述引物组检测I型诺如病毒的方法，包括有如下步骤：

1)待检测病毒RNA的提取：

用病毒RNA提取试剂盒提取待检测样品的病毒RNA；

2)用逆转录引物NVGI-F1、NVGI-R1逆转录扩增样品的病毒RNA得到逆转录产物；

为了增加浓度，用NVGI-F2和NVGI-R2再次扩增NVGI-F1、NVGI-R1的逆转录产物；

3)滚环扩增步骤：用步骤2)的逆转录产物为模板，用引物组NVGI-RCAF、NVGI-RCAR和NVGI-RCAP进行扩增，扩增温度为60℃，恒温水浴反应60min，80℃加热2min，终止反应；

4)结果检测：扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳后在琼脂糖凝胶上形成阶梯状的条带为阳性样品。

本发明引物组及方法的有点如下：