[发明专利]一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸荧光探针，更确切地说涉及一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，所述的探针可以应用于实时荧光定量PCR反应检测等，属于生物技术领域。

背景技术

荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。

早期的实时PCR核酸检测技术使用荧光染料指示PCR反应产物的累积过程，例如SYBR GREEN，EVE GREEN等。染料法简单，成本低，无需设计特殊的探针，然而由于其是通过识别双链DNA的量来表征PCR产物的积累，所以，无法区分非特异扩增或引物二聚体引起的非特扩增，在实际应用中还是受到了很大的限制。

随后，人们开始应用荧光基团标记的寡核苷酸片段特异性识别并指示PCR扩增产物，例如TaqMAN探针、分子信标、荧光共振能量转移探针(相邻探针)、蝎型探针(scorpions)等。与靶分子特异性结合的TaqMAN探针会在PCR扩增过程中通过Taq DNA聚合酶的5’外切酶的作用切除5’末端的荧光分子使之游离，从而释放荧光信号，被破坏的探针无法可逆恢复，因此TaqMAN探针虽然拥有更大的信号放大作用，检测的灵敏度更高；但是由于荧光基团和淬灭基团距离较远，荧光淬灭不完整，荧光本底较高。分子信标相反，荧光分子与淬灭分子毗邻，距离较近，荧光淬灭完整，因此荧光本底较低；但是分子信标在PCR反应过程中不被破坏，因此信号放大作用仅仅依靠PCR产物累积，检测的灵敏度较低。蝎行探针类似于分子信标，其缺点也是信号放大能力较TaqMan探针逊色。

本发明拟公开一种新型的用于荧光定量PCR反应的荧光探针。所述的探针结合分子信标与TaqMAN探针的双重优势，一方面克服TaqMan探针荧光本底高的缺陷，另一方面又克服分子信标信号放大能力差的问题，与一般荧光探针相比，荧光本底低，检测特异性高，灵敏度高，可应用于实时荧光定量PCR反应及荧光终点检测PCR技术，所以既克服了现有技术存在的缺陷又具有很高的实用价值。

发明内容

本发明的目的在于构建一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，命名为TLoop。所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5’端修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团。在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放的荧光信号。在PCR反应复性温度条件下，5’端序列优先与靶序列结合，5’端荧光报告基团在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶作用下断裂下来，并释放出荧光信号。

所述的“一定条件”指PCR反应或杂交反应过程中所需要的一定的缓冲条件、离子强度和表面活性剂浓度等条件。

所述探针5’端靶序列结合序列特征，包括Tm值与一般TaqMan探针相同，所述的探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以适当的LNA修饰，3’端反向互补回文结构序列根据5’端序列的GC含量的不同设计为5-12个碱基(核苷),7-9个碱基对最优。

所述探针所形成的分子内发夹结构，其5’端(荧光报告基团修饰端)突出0-5个碱基(核苷)，以利于与靶序列的快速结合且大限度的淬灭荧光信号。3-5个碱基为最佳。

针对荧光修饰，理论上，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团对(荧光基团及其对应的淬灭基团)都可以用在探针修饰上，荧光基团最常用的比如FAM(carboxy-fluorescein，羧基荧光素)、TET(Tetrachloro fluorescein，四氯-6-羧基荧光素)、HEX(Hexachloro fluorescein，六氯-6-甲基荧光素)、VIC、5-TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明)、ROX(X-rhodamine，罗丹明X)、Texas Red-X(德克萨斯红)、cy3(Indodicarbocyanine 3，吲哚菁类染料3)、cy5(Indodicarbocyanine 5，吲哚菁类染料5)、JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)等；荧光淬灭基团最常用的比如BHQ(Black Hole Quencher)系列，Dabcyl(4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸)、Eclipse等。