[发明专利]一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针

权利要求书

1.一种用于荧光定量PCR反应的荧光探针，其特征在于所述的探针包含一条寡核苷酸序列，其5’端为扩增靶序列特异性寡核苷酸序列，并在5’端修饰荧光基团，3’端为一段与5’序列反向互补回文结构核苷酸序列，并修饰荧光淬灭基团，在一定条件下，该探针形成分子内二级结构，荧光基团与淬灭基团靠近从而淬灭荧光基团释放出荧光信号；

所述的探针，命名为TLoop；

所述的一定条件，指PCR反应或杂交反应过程中所需要的缓冲条件、离子强度和表面活性剂浓度。

2.按权利要求1所述的探针，其特征在于在PCR反应复性温度条件下，5’端序列优先与靶序列结合，5’端荧光报告基团在Taq DNA聚合酶的5’端外切酶作用下断裂下来，并释放出荧光信号。

3.按权利要求1所述的探针，其特征在于所述的探针使用的核苷酸为DNA、RNA或辅以适当的LNA修饰，但5’端第一碱基修饰荧光基团是被TaqDNA聚合酶的5’外切酶剪切。

4.按权利要求1所述的探针，其特征在于5’端靶序列互补片段Tm值高于PCR复性温度2-10℃；3’端反向互补回文结构序列根据5’端序列的Gc含量的不同，设计为5-12个核苷。

5.按权利要求1所述的探针，其特征在于形成的分子内发夹结构，5’端序列突出0-5个碱基。

6.按权利要求1或5所述的探针，其特征在于5’端序列突出3-5个碱基。

7.按权利要求1或4所述的探针，其特征在于3’端反向互补回文结构序列为7-9个碱基。

8.按权利要求1所述的探针，其特征在于：

①针对修饰荧光，所有存在荧光共振转移作用的荧光基团-淬灭基团对都可以用在探针修饰上，所用的荧光基团是FAM、TET、HEX、VIC、5-TAMRA、ROX、Texas Red-X、cy3、cy5或JOE；荧光淬灭基团最常用的比如BHQ系列，Dabcyl或Eclipse；

②在荧光定量PCR反应过程中，存在PCR反应的变性、复性和延伸三个温度阶段，在变性阶段时，探针颈环结构解离，复性阶段中，当体系中含有匹配模板时，探针环状结构区域与模板结合，使探针的颈环结构无法恢复，探针5’端与模板完全结合，在PCR延伸过程中，Taq DNA聚合酶通过5’外切酶的作用剪切探针，探针5’端荧光素从探针上解离，彻底释放出荧光信号；若体系中不含目标DNA，复性过程中探针无法与模板结合，探针倾向于颈环结构恢复，荧光信号被淬灭；经过多个循环以后，被剪切下来的荧光素逐步累积，从而达到检测靶DNA的作用。

9.权利要求1所述的探针的应用，其特征在于用于实时荧光定量PCR检测和数字PCR技术检测；用作实时荧光定量PCR检测时，复性温度检测荧光信号，为使探针维持颈环结构，在延长茎干区域的长度，或者在茎干区域添加LNA核苷，以提高茎干双链区域的Tm值；用于数字PCR平台终点检测方法时，对探针茎干区域的Tm值只要求5-10个碱基。

10.按权利要求9所述的应用，其特征在于具体步骤是：

A：基于TLoop探针的荧光定量PCR技术检测EGFR基因L858Q突变

1、探针及引物设计与合成

根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp；TLoop探针TL858序列为5’-FAM--BHQ1-3’；TaqMan探针TM858序列为5’-FAM--BHQ1-3’；其中，探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域；

然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存，使用时稀释10倍；

2、荧光定量PCR体系的配制

将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制，DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒，纯化、定量后用TE缓冲液稀释到终浓度分别为10⁵copies/μL、10⁴copies/μL、10³copies/μL、10²copies/μL、10¹copies/μL，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照；

3、PCR反应及数据分析

反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，58℃20s，检测FAM荧光信号，共50个循环；

与一般的TaqMan探针相比，扩增曲线很好，检测灵敏度可以达到10个拷贝的核酸，灵敏度高，阴性对照没有起峰，说明探针的特异性优于一般的TaqMan探针；

B：基于颈环探针的数字PCR技术检测EGFR基因L858Q突变

1、芯片制作

通过模塑法制作PDMS芯片，首先将PDMS预聚体与固化剂按照质量比10：1混合，抽真空除气，浇注在预先制备好的硅片模具上，另外在载玻片上薄涂一层相同的PDMS，静置1h，放于65℃热板上预固化30分钟，将浇注于模具上的PDMS剥离，打孔，将有管道面与涂层后的玻璃涂层面贴合在一起，并在进样槽上方加盖一盖玻片；最后将贴合好的PDMS放入85℃的热板上加热10min，使其键合；

2、探针及引物设计与合成

根据人EGFR基因第21外显子L858Q基因突变类型设计引物和探针，上游引物E21F序列为5’-cgcagcatgtcaagatca-3’，下游引物E21R序列为5’-cctccttactttgcctcc-3’，PCR产物长度92bp；TLoop探针TL858序列为5’-FAM--BHQ1-3’，TaqMan探针TM858序列为5’-FAM--BHQ1-3’，其中，探针框起来的碱基为突变位点，灰色阴影部分为茎干结构区域；

然后将上述引物及探针设计好后送英潍捷基公司合成，合成产物用无菌去离子水稀释至终浓度100μM储存，使用时稀释10倍；

3、荧光定量PCR体系的配制

将探针和引物用无菌去离子水稀释到终浓度10μM，各PCR组分按以下配方配制。DNA模板为包含EGFR L858Q基因突变的人工质粒，浓度10³copies/μL；

4、进样

首先制备PCR预混液，在样品进样口注入PCR预混液，油进样口注入含乳化剂的含3％Abil EM90液体石蜡，将注射器置于泵上，利用负压泵的抽吸作用，PCR预混液及石蜡油由进样口朝出样口方向流动，在芯片十字交叉结构处PCR预混液在两侧石蜡油的夹流作用下切割形成纳升级的乳滴聚集在芯片的乳滴收集区，进样结束后用PDMS封闭进样及出样口；

5、PCR反应及数据分析

将该芯片即可放入PCR仪进行在片的原位PCR扩增，PCR循环程序为：95℃10min预变性，95℃10s，58℃40s循环，共35个循环，最后采用荧光显微镜观察结果，CCD照相，计数荧光信号阳性乳滴。