[发明专利]一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的联合检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的联合检测方法及试剂盒，尤其涉及一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法及其检测试剂盒。

背景技术

胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的前体，是分子量为42000Da的单链多态，依据其生化性质和免疫原性将其分成两个亚群。组分1-5的免疫原性相同称PGⅠ，主要由胃腺的主细胞和黏液颈细胞分泌，大部分进入胃腔；组分6-7称PGⅡ，由胃体的胃底黏膜的泌酸腺的主细胞、泌酸腺的黏液颈细胞、贲门腺和胃窦的幽门腺的黏液细胞以及十二指肠上段的Brunner腺分泌。正常情况下约1％的PG进入血液循环，进入的量十分稳定，因此血清中PG含量可以反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映了胃黏膜不同部位的分泌功能。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG含量也随之改变，被称为胃黏膜的“血清学活检”。

国内外临床研究指出，当30ng/ml<PG Ⅰ<67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ>7.5ng/ml时，表明胃粘膜轻度萎缩或胃蛋白酶原分泌减少，可能与浅表性胃炎、萎缩性胃炎或胃酸分泌过少有关；当30ng/ml<PG Ⅰ<67ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ<7.5ng/ml时，表明胃粘膜细胞萎缩，可能与轻度、中度萎缩性胃炎或肠化生、异性增生有关；当PG Ⅰ<30ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ>3ng/ml时，表明胃粘膜萎缩，可能与萎缩性胃炎或肠化生、异性增生等疾病有关；当PG Ⅰ<30ng/ml，PG Ⅰ/PG Ⅱ<3ng/ml时，表明胃粘膜严重萎缩，可能与重度萎缩性胃炎、肠化生、异性增生或胃癌等疾病有关；当PG Ⅰ正常，PG Ⅰ/PG Ⅱ<7.5ng/ml时，表明胃蛋白酶原Ⅱ分泌增加，可能与胃窦炎、肠化生、异性增生或浅表性胃炎有关；当PG Ⅰ高于正常值，PG Ⅰ/PG Ⅱ>7.5ng/ml时，表明胃粘膜暂时性受损，可能与饮食、胃溃疡、十二指肠溃疡或糜烂性胃炎有关；当PG Ⅰ高于正常值，3ng/ml<PG Ⅰ/PG Ⅱ<7.5ng/ml时，表明胃粘膜受损，可能与胃溃疡、十二指肠溃疡、糜烂性胃炎、浅表性胃炎或萎缩性胃炎有关，其中H.Pylri感染的可能性很大；当PG Ⅰ高于正常值，PG Ⅰ/PG Ⅱ<3ng/ml时，表明H.Pylri感染或肠化生、异性增生，可能与胃窦炎、肠化生、异性增生有关。通过PG的血清检测可以初步筛查胃溃疡、胃炎、肠化生、H.Pylri感染和胃癌等消化道疾病，而且检测方便、经济，适用于普通人群。

目前PG的主要检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)和化学发光免疫测定(CLIA)。ELISA法检测精确、能准确定量，具有很高的敏感性，但是检测样品需要加样、温浴、洗涤、显色、终止等步骤，操作程序繁琐，耗时长，样品从处理到得出结论需要至少40min，不适于大规模的体检筛查；样品检测需要洗板机和酶标仪，携带不便，因而不能在病人家庭或急救车上进行检测；另外其敏感性、特异性不够高，对低浓度样品检测的准确度不高。而化学发光免疫测定，虽然精确度高、检测速度快，但检测需要昂贵的化学发光免疫分析仪，要求特定的分析室，另外其试剂成本也较高，无法广泛用于较基层的医院和医疗机构中。

有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加以研究创新，以期创设一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的检测方法及试剂盒，使其更具有产业上的利用价值。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的联合检测方法及试剂盒。

本发明的胃蛋白酶原Ⅰ的双波长荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤：

1)免疫层析试纸条制备：将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鸡IgY分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上，经干燥、切割后得到免疫层析试纸条；

2)冻干探针制备：将两种不同发射光波长的荧光胶乳微粒溶液按比例混合，混合均匀后加入活化剂反应一段时间，离心、洗涤后得到活化荧光胶乳微粒；

将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和羊抗鸡IgY分别按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应一段时间，得到胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体荧光胶乳微粒、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒以及羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒；

随后将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体荧光胶乳微粒、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，随后加入硅藻糖水溶液稀释，冻干后保存为冻干探针；