[发明专利]一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的联合检测方法及试剂盒

权利要求书

1.一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)免疫层析试纸条制备：将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鸡IgY分别包被在层析试纸的检测线1、检测线2和控制线上，经干燥、切割后得到免疫层析试纸条；

2)冻干探针制备：将两种不同发射光波长的荧光胶乳微粒溶液按比例混合，混合均匀后加入活化剂反应一段时间，离心、洗涤后得到活化荧光胶乳微粒；

将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和羊抗鸡IgY分别按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应一段时间，得到胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体荧光胶乳微粒、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒以及羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒；

随后将胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体荧光胶乳微粒、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，随后加入硅藻糖水溶液稀释，冻干后保存为冻干探针；

3)样品稀释液制备：样品稀释液为含有牛血清白蛋白、蛋白保护剂、表面活性剂和防腐剂的缓冲液；

4)样品检验：将血清样品与冻干探针混合分散一段时间后，取出一定量加入样品稀释液中，待混合均匀后滴加至免疫层析试纸条上进行免疫层析反应；随后在荧光检测器下采用与两种荧光胶乳微粒相对应的两种发射光波长进行荧光检测。

2.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：所述冻干探针制备步骤中，将两种不同发射光波长的荧光胶乳微粒溶液按1:5～5:1比例混合，混合均匀后加入活化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐室温下反应0.5～2h，其中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为0.5:100～5:100。

3.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：所述冻干探针制备步骤中，所述两种荧光胶乳微粒的发射光波长分别为500～590nm和600～740nm。

4.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：所述冻干探针制备步骤中，胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.01:100～0.05:100，混合后室温下偶联反应2～5h；胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.01:100～0.05:100，混合后室温下偶联反应2～5h；羊抗鸡IgY与活化荧光胶乳微粒的混合比例为0.01:100～0.05:100，混合后室温下偶联反应2～5h。

5.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：所述冻干探针制备步骤中，按1:3～3:1的比例混合胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体荧光胶乳微粒和胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将其按3:1～8:1的比例与羊抗鸡IgY荧光胶乳微粒混合，得到混合荧光胶乳微粒，将混合荧光胶乳微粒用含糖量5～30％的硅藻糖水溶液稀释10～50倍，在-80℃下冷冻2h，取出后在-30～-50℃冷阱温度下冷冻干燥10～20h，密封保存于4℃。

6.根据权利要求1所述的胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测方法，其特征在于：所述样品稀释液制备步骤中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin。

7.一种胃蛋白酶原Ⅰ和Ⅱ的双波长荧光免疫层析联合检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒体、冻存管、以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括塑料衬板以及固定在塑料衬板上的样品垫、免疫层析试纸条和吸水纸，所述样品垫和吸水纸分别搭接在所述免疫层析试纸条的两侧，所述免疫层析试纸条上设置有检测线1、检测线2和控制线，所述检测线1、检测线2和控制线内分别包被有胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和鸡IgY；所述冻存管中存放有冻干探针，所述冻干探针为由胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体、胃蛋白酶原Ⅱ单克隆抗体和羊抗鸡IgY分别与两种不同发射光波长的荧光胶乳微粒反应制得的冻干探针，所述稀释液瓶中存放有样品稀释液。