[发明专利]一种提高丝状真菌纤维素酶产量和木质纤维素降解利用的菌株构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，一种高效表达生产纤维素酶和提升木质纤维素降解能力的方法，主要涉及一个纤维寡糖转运类似蛋白CLP1（NCU05853）在粗糙脉孢菌纤维素酶诱导表达和它在纤维二糖转运中的作用的发现，以及NCU05853同一个纤维寡糖转运蛋白NCU008114和三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755的组合基因突变菌株的构建和纤维素酶产酶，以及利用NCU05853和纤维寡糖转运蛋白NCU08114同三个β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952、NCU08755及碳代谢阻遏蛋白CRE1（NCU08807）的系列突变菌株作为基础菌株构建的其他菌株提升微生物产纤维素酶和木质纤维素降解能力。

背景技术

随着化石燃料，例如石油的不断挖掘，逐渐枯竭，以及对环境造成的污染等问题，寻找新的替代能源迫在眉睫，利用大量廉价的生物质（木质纤维素）作为原料发酵生产生物燃料一直是近年的研究热点。以木质纤维素为原料的生物炼制主要有三个步骤：预处理，酶解和糖利用。其中酶解是生物炼制过程中的一个重要的部分，也是需要解决的一个瓶颈问题。

木质纤维素的结构和成分复杂，其主要是由纤维素、半纤维素、果胶以及酚醛聚合物木质素所组成。纤维素主要是由D-葡萄糖单元通过β-1,4键连接成的线性多聚葡萄糖链。在结晶纤维素中，这些多聚链通过氢键包裹形成高度不溶的结构。半纤维素是自然界中仅次于纤维素的丰富的多聚物，其结构比纤维素更加复杂，由不同糖单元组成。木质纤维素的复杂成分及结构决定了其降解需要一系列的酶协同作用下来完成，其中纤维素完全降解为葡萄糖需要外切葡聚糖酶，也称为纤维二糖水解酶（EC3.2.1.91；1,4-β-D-glucancellobiohydrolases），从多聚物的尾部水解出纤维二糖；内切葡聚糖酶（EC3.2.1.4；1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase），主要是从纤维素链的内部无定型区域酶切，为外切葡聚糖酶提供更多的作用位点。β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21）将纤维二糖水解成葡萄糖。

自然界中很多微生物可以生产纤维素酶去降解木质纤维素，例如很多丝状真菌。但大多数野生型丝状真菌生产的纤维素酶对于木质纤维素的水解效率无法达到工业生产水平，因此这些真菌被改造，从而提高纤维素酶的产量以及水解效率。真菌菌种改造，一方面是传统诱变，工作量大，当菌种达到一定程度后，再使用传统诱变的方法进行改造，上升空间有限。另一方面是通过机理研究使用分子手段的理性改造。通过改造一个或多个基因来达到提高纤维素酶的目的。改造基因的选择是最终能否提高菌株纤维素酶的关键因素。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种提高真菌产纤维素酶和提升纤维素降解利用的菌种改造方法，核心发明点是首次发现一个纤维寡糖转运蛋白类似蛋白CLP1(NCU05853)的功能是抑制纤维寡糖转运，通过组合改造（敲除、突变等）微生物的纤维寡糖转运类似蛋白CLP1和纤维寡糖转运蛋白以及β-葡萄糖苷酶基因和碳代谢阻遏基因CRE1（NCU08807)，得到多个纤维素酶显著提升的组合突变体.尤其是5突变菌株（CPL7：Δ3βGΔcdt2Δncu05853），和6突变菌株（CPL9：Δ3βGΔcdt2Δncu05853Δcre1）纤维素酶产酶和纤维素降解利用能力显著提升。本发明包括但不限于该5突变体和6突变体的系列组合突变可以用来发酵生产纤维素酶和利用纤维素生产生物基化学品。

第一方面，本发明提供用于生产纤维素酶的多基因突变菌株，能够在纤维二糖以及纤维素诱导条件下表达含纤维二糖水解酶CBH1和CBH2在内的纤维素酶系；为以下菌株之一：

a.命名为CPL7（Δ3βGΔcdt2Δncu05853）的基因突变菌株，是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白CDT-2（NCU08114）以及β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755的微生物菌株；

b.命名为CPL9（Δ3βGΔcdt2Δncu05853Δcre1），是敲除纤维寡糖转运类似蛋白NCU05853和纤维寡糖转运蛋白CDT-2（NCU08114）和β-葡萄糖苷酶基因NCU00130、NCU04952和NCU08755以及碳分解代谢物阻遏蛋白CRE-1（NCU08807）的微生物菌株；