[发明专利]适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法。

背景技术

西瓜是一种重要的蔬菜作物，在世界10大果品中居第5 位，作为一种高产值的经济作物在世界各地被广泛种植。随着人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求越来越高，西瓜的育种目标也趋向于多元化的发展。但是传统的遗传育种存在种质资源匮乏，育种周期太长，后代表现出的遗传性状不稳定等不足；而通过离体培养、遗传转化等生物技术获得高产优质的品种已成为重要的植物育种手段之一。

离体培养下没有经过受精过程，但经过胚胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚结构称为体细胞胚。体细胞胚不仅可为研究细胞分化、细胞全能性机理和人工种子提高理想实验体系和技术基础，还具有可长期保存、遗传稳定性高、再生频率高的优点，同时还利于突变体的选择，还可作为制备原生质体的材料。具体的，经体细胞胚途径再生植株对于西瓜的快速繁殖、种质资源的保存、优良性状的培育以及基因工程受体系统的优化等都具有十分重要的理论意义和应用价值。

然而，现有技术中关于西瓜体细胞胚诱导及植株再生的成功报道却很少，且不同西瓜品种的组培条件差异极为显著，成功的报道可重复性很低，且只能针对一到两个基因型。1993年Compton和Gray用西瓜幼胚子叶为外植体成功诱导了体细胞胚再生，诱导率最高只有7%左右，且不同基因型之间的差异很大，之后牛姗姗(2006)和宋尚伟等(2007)以西瓜幼苗子叶为外植体，报道了最高25%和27.5%的体细胞胚诱导率，而诱导所得体细胞胚的质量和每外植体体细胞胚发生数量也均较低或者无据可查。在组织培养过程中，尤其重要的是培养基的选择及其激素的添加，这对于无菌苗的质量、愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生具有重要的影响，是决定外植体体细胞胚发生和植株再生的关键环节。然而，不同培养基及激素在不同基因型上的表现具有很大差异性，现有技术仍未找到一种适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法。

因此，建立一个适用于多基因型的西瓜高频体细胞胚发生及植株再生方法，具有重大意义，可为西瓜的优良育种及转基因研究等其它相关方面研究提供良好的受体再生系统。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的西瓜高频体细胞胚发生及植株再生方法。该方法包括以下步骤：

    1）前处理：将西瓜种子剥去种皮后进行灭菌，再将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培养，每瓶接种8粒，接种后先置于黑暗条件下培养3 d，培养温度为23-27℃，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养3 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为0-0.1 mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    2）愈伤组织的诱导：切取子叶外植体，放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基中，先置于黑暗条件下培养7 d，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养14 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    3）体细胞胚的诱导：将步骤2）所得愈伤组织放入含6-BA和 IAA的1/2 MS培养基中，在光照时间为16 h/d的条件培养28 d获得体细胞胚，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    4）完整植株的形成：将步骤3）所得的体细胞胚放入无激素的装有1/2 MS培养基的培养瓶中进行培养，培养时间为28 d，培养温度为23-27℃，光照强度为3000 lx，光照时间为16 h/d，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6.0 g/L的琼脂，pH值调至6；

    5）炼苗：选取经步骤4）培养后的具有3个以上叶片和5-6 cm强直根的健壮小苗，将培养瓶的盖子先拧松放置2 d，再半开2 d，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断补充水分；

6）移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27℃下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养，1-2周后再移到室外进行培养。