[发明专利]一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，具体涉及一种同时具有高自噬活性和胰岛素抵抗性的耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法。

背景技术

胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)就是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，即靶组织对胰岛素反应的敏感性下降，由此，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。IR是II糖尿病(T2DM)发病的重要机制之一，改善IR是T2DM的基础研究及药物开发的重点。肝脏是胰岛素作用的靶组织之一，是胰岛素抵抗发生的主要部位。胰岛素敏感性降低可导致肝脏葡萄糖异生和葡萄糖输出增加与餐后高胰岛素血症，高胰岛素水平能进一步加重胰岛素抵抗程度，并促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡，而胰岛素抵抗更是与包括肝癌等多种肿瘤的发生、进展、转移以及预后不良密切相关，还可促使肿瘤细胞对常规抗癌药物产生抗性，降低肿瘤治疗效果，产生肿瘤多药耐药(MDR)的作用。另外胰岛素抵抗的发生可以通过增加机体氧化应激水平而诱导自噬的发生。自噬是由内质网来源的双层膜结构包裹细胞质中的变性蛋白和受损细胞器形成自噬泡，并携带进入溶酶体内进行降解和加工的过程，其在肿瘤细胞发生发展中具有复杂的作用，因而建立高自噬活性的胰岛素抵抗肝癌细胞模型，便于观察胰岛素抵抗与自噬的关系，了解在肝癌中二者作用消长对于化疗药物敏感性影响及其作用机制，特别是方便于筛选与肝癌耐药性相关的指标、选取抵抗肝癌耐药的高效化疗药物具有重要价值。

HepG2细胞源于人肝胚胎瘤细胞，保留了肝细胞许多特征的同时也具有肿瘤细胞的特性，其表达高亲和力的胰岛素受体，发挥葡萄糖摄取、糖原合成酶的活性，脂类生成及RNA的合成等作用，同时也具有无限增殖能力和一定的化疗药物耐受性。目前，在胰岛素抵抗和自噬的研究中，尤其研究胰岛素抵抗与自噬机制的联系、化疗药物的筛选及作用靶点、探索肿瘤耐药性早期诊断靶点方面，迫切需要一种同时兼备胰岛素抵抗性、高自噬性，同时又是肿瘤的细胞模型。近年来研究人员已成功复制了多种胰岛素抵抗细胞模型，大多数模型的诱导困难、耗时长且不具备较长时间的稳定性，这些模型对于在较长时间对胰岛素抵抗及其耐药机制的观察有很大程度的局限性。另外，迄今还未有报道建立同时具备胰岛素抵抗性和高自噬活性的耐药肿瘤细胞模型。因此，建立一种简单、稳定、经济，同时具备胰岛素抵抗及高自噬活性的耐药细胞模型显得尤为重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种简单、稳定、经济、典型的耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，该细胞模型同时具有高自噬活性和胰岛素抵抗性。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种耐药肝癌HepG2细胞模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)预处理细胞：将常规培养的肝癌HepG2细胞接种于含10％DMEM培养基中在37℃，5％CO₂培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用；

(2)建立细胞模型：先用无血清培基洗涤步骤(1)中备用的肝癌HepG2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5～1μmol/L胰岛素，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37℃孵育15min；再用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，即成。

进一步，步骤(1)中，从常规培养的肝癌HepG2细胞中选取生长良好并处于对数生长期肝癌HepG2细胞，接种于含10％DMEM培养基中在37℃，5％CO₂培养箱中孵育至少12h，使之完全贴壁后备用。

进一步，步骤(2)中，先用无血清培基洗涤步骤(1)中备用的肝癌HepG2细胞，接着更换无血清的DMEM培养液同步化6h，然后加入0.5μmol/L胰岛素，置于37℃，5％CO₂培养箱中孵育72h，从培养箱中取出弃培养上清液，接着用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤2次，然后再用pH 6.0的酸性DMEM培养液37℃孵育15min；再用0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，即成。