[发明专利]可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用及其ELISA试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备ELISA试剂中的应用和检测I型鸭病毒性肝炎血清抗体的ELISA试剂盒。

背景技术

我国是世界上养鸭数量最多的国家，鸭的饲养量约占世界的70％，养鸭业在我国农业经济中占有重要地位。鸭肝炎病毒(Duck Hepatitis Virus，DHV)可引起雏鸭的鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)。DVH是一种高度致死性传染病，以发病急、病程短、发病率和死亡率高为特点。

鸭肝炎病毒属于小RNA病毒科(Picornaviridae)禽肝炎病毒属(Avihepatovirus)，本病毒有三个血清型，分别为DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，无免疫交叉反应。在我国，主要流行1型鸭病毒性肝炎，给我国养鸭业造成了巨大的经济损失，威胁着养鸭业的健康发展。因此对DHAV等鸭源病毒进行研究具有重要的社会和经济意义。

对鸭肝炎及鸭肝炎病毒进行研究，离不开鸭肝炎病毒及其抗体的检测试剂及检测方法。可用于DHV及其抗体检测的试剂及方法虽很多，如血凝实验、协同凝集实验、中和实验、琼脂扩散、ELISA、荧光抗体、免疫组化、胶体金等。而目前最常用且可靠的方法仍是中和试验，但因其操作复杂、费时、成本高，不能用于快速检测因而不适于基层推广应用。ELISA法具有操作简便快速、特异性强、敏感性高、重复性好等优点。早在1991年，Zhao等运用中和实验、琼脂扩散试验、ELISA法对DHV抗体进行检测，阳性检出率分别为18.8％、68.8％和68.8％；杨萍萍等以氯仿去脂、0.22μm孔径滤膜过滤、凝胶柱浓缩层析方法纯化得到的病毒作为包被抗原，也建立了检测DHV血清抗体的间接ELISA方法。但该方法在具体使用中受到限制，一致未能推广，其主要原因之一是检测DHV血清抗体的间接ELISA方法对抗原纯度要求很高，但由于病毒必须依靠宿主细胞才能增殖，因此进行全病毒抗原纯化时难于与宿主蛋白分离。

随着对DHAV-1分子生物学研究的不断深入，将重组表达蛋白(特别是大肠杆菌原核表达蛋白)抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测中成为可能。大肠杆菌表达的重组蛋白抗原易于制备和纯化，且表达重组蛋白抗原的宿主细胞大肠杆菌比制备DHV抗原的宿主细胞(如鸭胚及鸭源细胞、鸡胚等)与DHV的宿主(鸭)亲缘关系更远，检测时由于抗原纯度而产生非特异性的可能性也减少。但重组表达的蛋白抗原运用到鸭肝炎病毒抗体的检测还有一个困难，就是大肠杆菌表达易形成不溶性的包涵体，包涵体由于杂蛋白含量较低、可避免蛋白酶降解、难溶于水等特点而使其易于分离纯化。包涵体中的目标蛋白虽然其肽链是完整的，但却是非天然形式、无生物学活性的表达蛋白，包涵体的溶解非常困难，需要用强变性剂高浓度尿素、SDS等来打断分子内和分子间的非共价键、离子键等，为获得有活性的蛋白，继而需要进行蛋白复性，而包涵体蛋白溶解后的复性不仅费时、费力，且复性率低。

DHAV具有微RNA病毒科成员相似的特点，为单股正链RNA，完整基因组长度约为7.7kb，由5’非翻译区、一个大的开放阅读框(ORF)、3’非翻译区组成，ORF含有6750nt，编码2249AA的多聚蛋白，随后被病毒编码的蛋白酶切割，首先分解成P1、P2和P3产物，然后P1、P2和P3(P1编码结构蛋白、P2和P3编码非结构蛋白)又进一步分别分解为VP0/VP1/VP3、2A1/2A2/2A3/2B/2C和3A/3B/3C/3D蛋白，产生12个成熟的病毒蛋白。3D是DHAV的一种非结构蛋白，虽然不是病毒粒子的组成成分，但在病毒生命循环中扮演着重要角色，在合成负链RNA、合成复制酶过程中占有主导的作用，加之其本身的酶催化活性，使得3D蛋白在病毒的生存过程中必不可少，因此，在病毒感染机体内可能产生3D抗体，但目前未见3D蛋白是否可以作为抗原检测DHAV抗体的ELISA方法报道；同时，获得高纯度有活性的抗原并应用于制备ELISA检测试剂盒，对于鸭病毒性肝炎抗体的检测的有重要的意义和推动作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供可溶性I型鸭肝炎病毒3D蛋白在制备检测I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂中的应用；本发明的目的之二在于提供检测I型鸭病毒性肝炎抗体ELISA试剂盒。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：