[发明专利]猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及灭活疫苗，尤其涉及猪支原体肺炎灭活疫苗，本发明进一步涉及制备该猪支原体肺炎灭活疫苗的方法，属于猪支原体肺炎灭活疫苗的制备领域。

背景技术

猪支原体性肺炎是由猪肺炎支原体引发的一种慢性肺炎，又称猪地方流行性肺炎，其病原最早由Mare、Switzer(1965)和Goodwin等(1965)从患肺炎猪的肺组织中分离出，并在实验室复制出本病，报导后该病原被命名为M.hyopneumoniae。长期以来，本病被认为是对养猪业造成重大经济损失、最常发生、流行最广、最难净化的重要疫病之一。本病虽为老病，但近年来由于经常和猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒等其它病原混合感染，造成重大的经济损失而突显出了其重要性。中国地方猪种对本病明显较引入品种易感。带菌猪是本病的主要传染源，病原体是经气雾或与病猪的呼吸道分泌物直接接触传播，其经母猪传给仔猪使本病在猪群中持久存在。其严重程度常因管理水平、季节、通风条件、猪的密度以及其它环境因素改变而有很大差异，最早可能发生于2～3周龄(地方品种有9日龄的)的仔猪，但一般传播缓慢，在6～10周龄感染较普遍，许多猪直到3～6月龄时才出现明显症状。易感猪与带菌猪接触后，发病的潜伏期大的为十天或更长时间，并且所有自然发生的病例均为混合感染，包括支原体、细菌、病毒及寄生虫等。

目前，预防猪支原体性肺炎的弱毒活疫苗存在操作复杂、不易推广的问题，亟待开发一种操作简单，免疫动物后能够提高体液免疫反应和增强免疫效果的猪支原体肺炎灭活疫苗。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种猪支原体肺炎灭活疫苗及其制备方法，该方法制备工艺简单，所制备的灭活疫苗免疫动物后能够提高体液免疫反应并增强免疫效果。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先提供了一种猪支原体肺炎灭活疫苗，所述灭活疫苗由水相和油相按照1：1-3的体积比组成；其中，所述的水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照2-5：95-98的体积比组成；所述的油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油(Kolliphor RH40)、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的体积比组成。

为了达到更好的技术效果，所述灭活疫苗由水相和油相按照1：1的体积比组成。

优选的，所述的水相由吐温-80和猪肺炎支原体菌液按照4：96的体积比组成；所述的油相由聚氧乙烯40氢化蓖麻油、司本-80和白油按照1：6：93的体积比组成。

本发明还公开了一种制备所述猪支原体肺炎灭活疫苗的方法，包括以下步骤：

(1)培养猪肺炎支原体菌液，收获菌液；(2)加入灭活剂将菌液灭活；(3)制备油相和水相，将油相和水相混合，乳化；(4)将乳化好的疫苗定量分装，密封，即得。

其中，步骤(1)中采用发酵罐培养的方式培养猪肺炎支原体菌液；所述的培养方式如下：按发酵罐容积5％-20％的量将猪肺炎支原体接种到培养基中，优选为PPLO肉汤培养基；在以下培养条件下进行培养：温度37℃、pH值7.0、搅拌转速40-60r/min，通气培养15-96小时；采用逐步扩大培养方式，一直到所需的量；收获菌液。对收获的菌液进行抗原浓度测定，要求5×10⁸变色单位≤抗原水平/头份≤2×10¹⁰变色单位。

步骤(2)中所述的灭活剂为二乙烯亚胺(BEI)，其终浓度达到2mmol/L，其中BEI用2-溴乙胺氢溴酸盐(BEA)与0.2mol/L的NaOH溶液在37℃下水浴1h(每隔15、20min摇匀一次)配制成所需浓度的BEI灭活液，以0.22μm滤膜滤器过滤除菌，2～8℃存放备用；

加入灭活剂后在37℃下搅拌培养至少24小时；然后加入硫代硫酸盐灭菌水溶液中和过剩的二乙烯亚胺，在37℃下再连续搅拌培养至少24小时。

步骤(3)中，所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油90-94份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1-2份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-805-8份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；优选的，所述油相的制备方法包括以下步骤：按体积比计，将白油93份加热到100℃，加入聚氧乙烯40氢化蓖麻油1份，混匀，将油温降到50℃以后加入司本-806份搅拌均匀，125℃灭菌30分钟，冷却后即得；