[发明专利]一种恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫化学技术领域，具体涉及具有高滴度、高亲和力以及高特异性的恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法，利用该单克隆抗体检测恩诺沙星残留的应用，以及分泌产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin)，又名乙基环丙沙星，是第一个畜禽专用的氟喹诺酮类药物，因其具有抗菌谱广、抗菌活性强、易吸收、体内分布广等优点而被广泛应用于兽医临床预防和治疗。由于该药物在动物性食品中残留而诱导人类致病菌产生耐药性这一问题的发现，我国农业部规定恩诺沙星在肌肉、牛奶中的最高残留限量(Maximum Residue Limit，MRL)不得超过100μg/kg。因此，加强对该药物在动物性食品中的残留检测和监督管理显得尤为突出。 

然而，作为半抗原的恩诺沙星本身不能诱导机体产生抗体，必须将其与载体蛋白偶联获得人工合成的完全抗原才具有抗原性。自2001年日本学者Hiroo Watanabe^[1]等首次制备特异性恩诺沙星单克隆抗体并且有效检测出食品样本中恩诺沙星残留以来，国内与食品安全相关科研机构相继开展了恩诺沙星免疫检测试剂盒的研制工作。2006-2009年，刘春娥、刘红、王振辉、蒋兴东等^[2-7]报道了恩诺沙星免疫检测方法的建立并对畜牧水产品中恩诺沙星残留的检测工作；2006-2012年，唐宏、沈建忠、陆茂林、孙远明、吴建祥等^[8-12]申报了与恩诺沙星免疫检测相关的国家专利。上述研究成果显示：国内对恩诺沙星检测灵敏度IC₅₀仅为10-50ppb，检测限IC₂₀为1-10ppb，有效检测浓度跨度(IC₂₀-IC₈₀)为1-100ppb(代表检测精度)，但这些检测参数并不尽如人意，进而难以转化为实际应用。与此相比，以德国Biopharm公司为代表的外国跨国公司的恩诺沙星ELISA检测试剂盒则具有更优异的检测参数，其检测灵敏度IC₅₀为1ppb，有效检测浓度跨度(IC₂₀-IC₈₀)为0.2-5ppb，几乎垄断了国内市场。陆茂林等用时间分辨荧光免疫分析替代常规的辣根过氧化物酶标记提高了试剂盒的检测限。但是这种方法仅仅放大了信号强度，却没有从根本上提高对应抗体对半抗原的亲和力，同时扩大了有效检测浓度跨度，大大地降低了检测精度；更为不利的是，这些技术的应用往往需要高级检测仪器或设备作为硬件支撑，此外还存在市场认可度等问题，严重制约了该方法的使用及推广。 

鉴于此，研发同水平检测产品已经成为当务之急，亟需一种具有高滴度、高亲和力以及高特异性的恩诺沙星单克隆抗体来满足工业及日常生活所需。 

发明内容

针对现有国产恩诺沙星免疫检测试剂盒检测灵敏度低，假阳性率高，实测样本主要依赖进口检测试剂盒的技术现状，本发明的目的在于提供一种效价高、特异性强、检测灵敏度高的恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法，进而为研发出水平同等于甚至优于进口产品的免疫检测试剂盒奠定基础。 

本发明的另一个目的在于提供分泌该恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

本发明的目的通过以下技术方案得以实现： 

本发明中分泌产生恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1；其中：14H4A1是小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO.C201487，于2014年5月6日保藏于湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心(简称为CCTCC，位于武昌珞珈山武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO.C201487；14F8B1是小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO.C201488，于2014年5月6日保藏于湖北省武汉市中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO.C201488。 

细胞株编号说明：对于14H4A1株而言，14H4代表融合细胞生长克隆第14号培养板的H栏第4列生长孔为阳性克隆孔，A代表该克隆进行第一轮亚克隆后分别编号为A和B的二个亚克隆中的A号株，1代表是A株细胞进行第二轮亚克隆后分别编号1和2的二个亚克隆中的1号株；14F8B1株的编号规则与此类同。 

由小鼠杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1分泌产生的恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’。 

本发明的恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’的制备方法，其包括以下步骤：