[发明专利]一种恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.分泌产生恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1，14H4A1是小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO. C201487，14F8B1是小鼠杂交瘤细胞系CCTCC NO. C201488。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1分泌的恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’。

3.根据权利要求2所述的恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）免疫原的制备：将恩诺沙星与牛血清白蛋白偶联，制备免疫原恩诺沙星-牛血清白蛋白偶联物；

2）动物免疫注射：以小鼠作为受免动物，按照免疫程序注射步骤1）中获得的免疫原与佐剂的混合物进行免疫，并采集血清样本；

3）候选受免鼠的确立：采用棋盘ELISA和间接竞争ELISA检测步骤2）中获得的血清样本，遴选用于细胞融合的候选受免鼠，腹腔注射加强免疫；

4）杂交瘤细胞株的获得：取步骤3）中获得的候选受免鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选阳性克隆，再对阳性克隆进行二轮亚克隆，获得分泌抗恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1；

5）单克隆抗体的获取：采用腹腔注射方式，向小鼠注射步骤4）中获得的分泌恩诺沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株14H4A1或14F8B1，7~10天后采集腹水，采用蛋白G树脂对腹水进行纯化，即得恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述偶联采用碳二亚胺法完成。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述佐剂包括弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤2）中所述免疫程序如下所述：设定每一次免疫的注射剂量均为100μg/只，两次免疫之间的时间间隔均为4周；免疫原与等体积的弗式完全佐剂乳化后采用腹腔注射方式进行第一次免疫；第三次免疫的方式及剂量与第一次相同，其中佐剂是弗氏不完全佐剂，其与免疫原的体积比为1:3；第五次免疫的方式及剂量与第一次相同，其中佐剂是弗氏不完全佐剂，其与免疫原的体积比为1:7，同时补加剂量为50μg/只的恩诺沙星标样；第二次及第六次免疫的方式为皮下多点注射，其中佐剂是与免疫原等体积的弗氏不完全佐剂；第四次免疫的方式为皮下多点注射，其中佐剂是与免疫原等体积的弗氏不完全佐剂，同时补加剂量为50μg/只的恩诺沙星标样。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤3）中所述遴选抗血清的标准为间接ELISA实验中进行效价检测的工作浓度大于1:50000且间接竞争ELISA实验中检测血清对恩诺沙星的抑制效果值IC₅₀小于等于5ng/ml。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤4）中所述骨髓瘤细胞为Sp2/0Ag14小鼠骨髓瘤细胞，以PEG1500作为融合剂，按照脾细胞:骨髓瘤细胞=8:1的比例进行细胞融合。

9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤5）中对小鼠腹腔注射分泌ENR单克隆抗体的杂交瘤细胞株的注射量为1~2×10⁶个/只。

10.根据权利要求2所述的恩诺沙星单克隆抗体14H4A1’或14F8B1’在制备用于检测恩诺沙星的试剂中的用途。