[发明专利]一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学方法进行病毒检测领域，具体涉及一种检测12 种呼吸道病毒的方法。

背景技术

呼吸道病毒是一大类能侵犯呼吸道主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，其中以呼吸道病毒最常见，包括流感病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、腺病毒等。并且，近年来新的致病性呼吸道病毒还在不断地被发现，如偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒等，给人类的健康构成很大的威胁。急性呼吸道感染大多具有潜伏期短、发病急、感染力强、传播快等特点，常可导致较高的发病率和死亡率，尤其受到环境变化和生态平衡破坏的影响，病毒易发生各种变异，常突然暴发，病情凶险，死亡率也较高。呼吸道病毒引起的感染症状比较相似，难以靠临床症状及常规检测方法进行明确诊断，因此，迫切需要一种高灵敏度、高特异性的方法进行筛查。

目前，我国常用的呼吸道病毒的检测方法主要包括以下几种：1、电子显微镜镜检 直接对标本中病毒进行形态学鉴定，缺点：①诊断效率低，且有些病毒难以直接从形态学上进行区分；②需要昂贵设备和有经验操作者。2、病毒分离培养 是病毒诊断“金标准”，缺点：①费时费力，且需要有经验操作者；②生物安全风险较高。3、免疫学检查 应用最广泛的是酶联免疫技术（ELISA），一般先用一抗与抗原发生特异性结合，然后用通用的酶标记的二抗与一抗发生特异性的结合，再将酶显色，之后观察结果；优点：①样品通量较高，利用96孔酶标板，可以同时完成多个样本的检测；②较敏感：利用酶联的特性，可以将原来的抗原信号放大；③比传统的培养法缩短时间。缺点：①易出现假阳性；②灵敏度不确定；③病毒抗原发生变异时出现假阴性结果。4 分子生物学—PCR检测方法：目前经常使用的有PCR、实时荧光定量PCR等，都是针对病毒的特异性靶基因进行检测。其中，荧光定量PCR检测方法最为成熟。其优点是：灵敏度高并可以精确定量。但是也存在以下缺点：①通量低，一般一次只能检测一种病毒，多重荧光检测时存在荧光干扰影响检测结果；②检测成本相对较高。

GenomeLab GeXP多重基因表达遗传分析系统基于贝克曼公司成熟的毛细管电泳分离技术及高灵敏度的激光诱导荧光技术研发而成，一束8道的毛细管陈列设计充分利用了96孔板的排列特性。采用多重PCR方法，通过燃料标记，在同一个PCR管中同时分析多个基因的表达，克服了上述呼吸道病毒检测方法存在的缺陷，具有以下优点：

1、高通量：采用双96孔板，实现单个反应检测12个位点，可同时做192个反应，一天出结果；对于交叉感染者，本方法可一次性给出准确报告，避免漏检。

2、准确性强：本方法采用毛细管电泳对PCR产物进行分离检测，可以将非特异性扩增产物、引物二聚体和特异性扩增产物分离，最大程度降低假阳性；

3、敏感性高，结果重复性好：本方法克服传统PCR扩增方法的不均等扩增造成的偏差，提高了对一套目的基因进行定量的速度和敏感性。

4、方法简便，使用经济：使用引物混合液，每个样品检测12个位点仅需一次加样；单个样品的检测成本低，利于大规模推广；

5、易于实现自动化。

发明内容

本发明目的是提供一种高通量、高灵敏度和高特异性的针对12 种呼吸道病毒的快速分子生物学检测方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：本发明所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组，其特征在于，包括针对 12 种呼吸道病毒和 1 种内对照基因的反转录引物， 其序列见表1：

表1

其中博卡病毒和腺病毒无RT引物，1 种内对照基因为人RNA内参，其基因的反转录引物为：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

在一种同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组中，包括针对 12 种呼吸道病毒和 3种内对照基因的PCR引物，其序列见表2：

表2

其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3 种内对照基因的PCR引物：①人RNA内参的PCR引物序列为： GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA内参的引物序列为：5’ CGCTAGGAATCAGACCAACAC 和5’ ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反应内参的引物序列为：5’ GCCAGATATACGCGTTGACA 和5’ AGGGCGTACTTGGCATATGAT。