[发明专利]一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法

权利要求书

1.一种同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组，其特征在于，包括针对 12 种呼吸道病毒和 1 种内对照基因的反转录引物， 其序列见表1：

表1

其中博卡病毒和腺病毒无RT引物，1 种内对照基因为人RNA内参，其基因的反转录引物为：CGGCATCTTCAAACCTCCAT。

2.一种同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组，其特征在于， 包括针对 12 种呼吸道病毒和 3种内对照基因的PCR引物， 其序列见表2：

 表2

其中博卡病毒和腺病毒有正反PCR引物，3 种内对照基因的PCR引物：①人RNA内参的PCR引物序列为： GCCGTGTGAACCATGTGAC；②人DNA内参的引物序列为：5’ CGCTAGGAATCAGACCAACAC 和5’ ATGGCGGTGTTTGCAGAT；③反应内参的引物序列为：5’ GCCAGATATACGCGTTGACA 和5’ AGGGCGTACTTGGCATATGAT。

3.一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）选取适当的目的基因相关序列，设计特异性检测12种常见呼吸道病毒的特异性引物具体的核苷酸序列如下表3：

表3

（2）取被检样品提取总核酸；

（3）以提取的总核酸为模板进行反转录；

（4）建立RT和PCR 反应体系，将上述引物以及各反应组份置于PCR 仪中，加入被检样品提取的DNA模板或反转录产物，进行扩增；

（5）以毛细管电泳的方法进行样品分离、鉴定。

4.根据权利要求3所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述的反转录引物包括10种呼吸道病毒的RT扩增引物和人RNA内参的RT扩增引物，所述的PCR引物包括2种呼吸道病毒的正反向PCR引物、人DNA内参的正反向PCR扩增引物、反应内参的正反向PCR扩增引物以及上述10种呼吸道病毒的PCR扩增引物及人RNA内参的PCR扩增引物。

5.根据权利要求3 所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤（2）中的被检样品包括患者的包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和痰液。

6.根据权利要求3 所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤（3），RT反应体系及反应条件为：5-20ng/μL的核酸样品5μL，DEPC水8μL，5×RT缓冲液4μL，RT引物2μL，RT酶1μL；混匀后进行反转录；反应条件是：48℃ 1分钟、42℃ 60分钟、95℃ 5分钟、4℃直至收取RT产物，反转录引物溶液中各RT引物的浓度为500nM。

7.根据权利要求3 所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤（4），PCR反应体系及反应条件：RT产物8.6μL，10×PCR缓冲液2μL，25mM氯化镁4μL，PCR引物溶液2μL，DNA聚合酶1.4μL，X溶液2μL；混匀后加入到PCR管中进行PCR反应，反应条件是：95℃10分钟、94℃ 30秒、55℃ 30秒、70℃ 1分钟，35个循环、70℃ 1分钟、4℃直至收取PCR产物；PCR引物溶液中各种PCR引物浓度均为200nM；所述的X溶液为包括三磷酸脱氧核苷酸和通用引物，所述的通用引物正向扩增引物序列为 GTACGACTCACTATAGGGA反向扩增引物序列为AGGTGACACTATAGAATA，所述的通用引物正向扩增引物带荧光标记。

8.根据权利要求3  所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述步骤（5）包括制备遗传分析仪样品、准备分离液、毛细电泳分离样品、结果分析的步骤。

9.根据权利要求3 或4或5或6或7或8 所述的一种同时检测12种常见呼吸道病毒的方法，其特征在于：所述反应体系设立有阳性对照和阴性对照；所述阳性对照是采用上述12种呼吸道病毒、RNA内参、DNA内参和反应内参的引物的基因基因重组克隆质粒；所述阴性对照是未使用的病毒采样液。

10.一种同时检测12种常见呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1所述的同时检测12种常见呼吸道病毒的反转录引物组和如权利要求2所述的同时检测12种常见呼吸道病毒的PCR引物组。