[发明专利]表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株

说明书

本申请是申请日为2011年1月13日、申请号为201180005978.1、发明名称为“表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株”的发明专利申请的分案申请。

本本发明涉及重组细菌宿主菌株，特别是大肠杆菌(E.Coli)。本发明还涉及在此细胞中产生目的蛋白质的方法。

发明背景

通常将细菌细胞，如大肠杆菌，用于生产重组蛋白质。使用细菌细胞如大肠杆菌生产重组蛋白质有很多优势，具体而言是因为细菌细胞作为宿主细胞可以使得基因通过质粒插入而具有多样的属性。大肠杆菌已经用于很多重组蛋白质的生产，包括人胰岛素。

尽管使用细菌细胞产生重组蛋白质有很多优势，但是仍然有显著的局限性，包括难以生产蛋白酶敏感型蛋白质。蛋白酶在大肠杆菌细胞周质和细胞质中转换老旧、损坏或折叠错误的蛋白质上起到重要作用。细菌蛋白酶起降解目的重组蛋白质的作用，因此常常显著降低活性蛋白质的产量。

已经鉴定出大量的细菌蛋白酶。大肠杆菌中的蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP和lon。

Tsp(也称为Prc)为一种60kDa的细胞周质蛋白酶。第一个已知的Tsp底物为青霉素结合蛋白质-3(PBP3)(Determination of the cleavage site involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3of Escherichia coli；Nagasawa H,Sakagami Y,Suzuki A,Suzuki H,Hara H,Hirota Y.J Bacteriol.1989Nov；171(11):5890-3和Cloning,mapping and characterization of the Escherichia coli Tsp gene which is involved in C-terminal processing of penicillin-binding protein 3；Hara H,Yamamoto Y,Higashitani A,Suzuki H,Nishimura Y.J Bacteriol.1991Aug；173(15):4799-813)，但后来发现Tsp还能够裂解噬菌体尾巴蛋白质，因此将其改名为尾特异性蛋白酶(Tail Specific Protease，Tsp)(Silber等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:295-299(1992))。Silber等人(Deletion of the prc(tsp)gene provides evidence for additional tail-specific proteolytic activity in Escherichia coli K-12；Silber,K.R.,Sauer,R.T.；Mol Gen Genet 1994242:237-240)描述了一种prc删除菌株(KS1000)，其中的突变是通过将包含Kanr标记物的片段取代prc基因的片段而形成的。

Tsp(prc)活性降低对降低目的蛋白的蛋白水解是可取的。然而，发现缺少蛋白酶prc的细胞在低渗透压下显示出热敏感生长概况。Hara等人分离了含有基因外抑制子(spr)突变的耐热性回复突变株(Hara等人,Microbial Drug Resistance,2:63-72(1996))。spr为18kDa的膜结合细胞周质蛋白酶，spr的底物为Tsp以及外膜中参与细胞分裂中细胞壁水解的肽聚糖。spr基因标记为UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_ECOLI)。