[发明专利]表达重组DSBC并具有降低的TSP活性的细菌宿主菌株

权利要求书

1.重组革兰氏阴性细菌细胞，特征在于所述细胞：

a.包含含有编码DsbC的重组多核苷酸的表达载体；

b.具有突变的Tsp基因，其编码与野生型非突变Tsp相比，具有50％或更低蛋白酶活性的Tsp蛋白质；并且

c.具有除了突变的Tsp基因外，与野生型大肠杆菌W3110菌株同基因的基因组。

2.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含编码突变spr蛋白质的突变spr基因，所述突变spr蛋白质具有选自H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A和G147C的一个或多个突变。

3.根据权利要求2的细胞，其中所述spr蛋白质的一个或多个突变选自S95F、V98E、Y115F、D133A、V135D、V135G和G147C。

4.根据权利要求3的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有突变S95F和Y115F。

5.根据权利要求2的细胞，其中所述突变spr基因编码的spr蛋白质具有选自C94A、D133A、H145A和H157A的突变。

6.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞进一步包含一种或多种以下突变基因：

a.编码具有分子伴侣活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白质的突变DegP基因；

b.突变ptr基因，其中所述突变ptr基因编码具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III或其为敲除突变ptr基因；以及

c.突变OmpT基因，其中所述突变OmpT基因编码具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白质或其为敲除突变OmpT基因。

7.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞包含的突变Tsp基因编码与野生型非突变Tsp相比，具有50％或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质或为敲除突变Tsp基因。

8.根据权利要求6的细胞，其中所述细胞包含的突变Tsp基因编码与野生型蛋白质Tsp相比，具有50％或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白质或为敲除突变Tsp基因。

9.根据权利要求7或权利要求9的细胞，其中所述细胞具有敲除突变基因，其包含对基因起始密码子的突变和/或位于基因起始密码子下游和基因终止密码子上游的一个或多个终止密码子。

10.根据权利要求7或权利要求9的细胞，其中所述敲除突变Tsp基因包含由对基因起始密码子的错义突变和任选地一个或多个其它点突变产生的限制性标记物位点。

11.根据权利要求7或权利要求9的细胞，其中所述敲除突变Tsp基因包含SEQ ID NO:3。

12.根据权利要求1或6的细胞，其中所述细胞包含编码目的蛋白质的多核苷酸序列。

13.根据权利要求1的细胞，其中所述细胞包含含有编码DsbC的重组多核苷酸以及编码目的蛋白质的多核苷酸序列的载体。

14.根据权利要求13的细胞，其中所述载体包含控制编码DsbC的重组多核苷酸以及编码目的蛋白质的多核苷酸序列的表达的启动子。

15.根据权利要求14的细胞，其中所述目的蛋白质为抗体或其抗原结合片段。

16.根据权利要求15的细胞，其中所述抗体或其抗原结合片段对TNF具有特异性。

17.用于产生目的蛋白质的方法，其包括：

a.在能够有效表达目的重组蛋白质及编码DsbC的重组多核苷酸的条件下，在培养基中培养根据权利要求1-16中任何一项限定的重组革兰氏阴性细菌细胞；以及

b.从重组革兰氏阴性细菌细胞的细胞周质和/或培养基中回收目的蛋白质。

18.根据权利要求17的方法，其中编码目的蛋白质的多核苷酸序列与编码DsbC的重组多核苷酸的表达是通过向培养基中添加诱导子而进行诱导的。

19.根据权利要求17或18的方法，其中所述方法进一步包括将目的蛋白质与DsbC分离。