[发明专利]一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用

说明书

本发明提供了一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6‑取代四氢吡喃‑2‑酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶‑化学合成方法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体，生产该葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌的构建，该葡萄糖脱氢酶突变体的生产及应用。

背景技术

本发明涉及制备如下式I所示的化合物的方法。

上述的化合物适于在若干药物活性成分的制备中作为中间体，特别是制备HMG-CoA还原酶抑制剂时，更特别地，制备斯达汀(statin)时，例如制备阿托伐他汀(Atorvastatin)时。现有技术中对于制备上述结构式I化合物的方法一般包括：

例如，Advanced Synthesis&Catalysis,2008,350,1751-59公开了6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇在液溴-水氧化下生成内酯；又如，美国专利US6870059公开了利用溴的溶液氧化6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇生成内酯的反应；再如，PNAS,2004,101,5788-93公开了6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇在次氯酸钠和冰醋酸氧化下生成内酯的反应；再如，国际申请WO2006134482中公开了6-氨基乙基-四氢吡喃-2,4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；再如，国际申请WO2009019561中公开了6-氨基乙基-四氢吡喃-2,4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；又如，国际申请WO2013068917中公开了如下式II所示的化合物在醇脱氢酶作用下生成式I所示的化合物，如下所示：

但是，上述的方法或者存在反应比较剧烈，后处理难以进行，或者存在对环境不友好的缺点，或者存在反应试剂价格昂贵等缺点，所以不适合工业化大生产的进行。

由于化学法存在着上述的缺点与不足，现在对于生物催化的方法开始进行较多的研究，比如：国际申请WO2013068917公开了(4R,6S)-6-氯代甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇在醇脱氢酶(ADH)作用下生成(4R,6S)-6-氯代甲基-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮的方法。Lek公司在Metabolic Engining上报道了用大肠杆菌来源的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)实现半缩醛到内酯的氧化，但是转化过程中需要补加昂贵的PQQ，成本较高。

发明内容

针对现有技术中半缩醛氧化成内酯的反应中反应比较剧烈，后处理难以进行，或者对环境不友好，或者反应试剂价格昂贵，添加了价格较为昂贵的辅酶，不适合工业化大生产等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明的第一方面提供了一种分离的葡萄糖脱氢酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：

(a)由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质。

SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有氧化脱氢的功能，是一种新的葡萄糖脱氢酶。