[发明专利]一种基于PCR的核酸传感器快速检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测方法，具体是一种基于PCR的核酸传感器快速检测方法。 

背景技术

聚合酶链式反应，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。PCR是利用DNA在体外摄氏95℃高温时变性会变成单链，60℃左右低温退火时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度72℃左右，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖5’-3’的方向合成互补链，可看作生物体外的特殊DNA复制。 

PCR技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低的优点，PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素溴化乙锭染色凝胶电泳是最常用的检测手段，然而溴化乙锭是强诱变剂，具有高致癌性，对环境造成极大的污染，危害人体健康。同时，电泳检测以琼脂糖或聚丙烯酰胺为介质，借助电泳仪、紫外透射光仪等进行，既耗时又费成本。因此，人们仍然需要寻找快速、灵敏、低成本、操作简易的检测工具代替传统的电泳检测。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作方便、检测成本低的基于PCR的核酸传感器快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。 

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 

一种基于PCR的核酸传感器快速检测方法，包括如下步骤：

1）设计得到一对针对待检物目标序列的特异性引物，分别记为F-Primer和R-Primer；

2）设计一段与特异性引物F-Primer的5’端Tag序列互补的序列，记为序列T；设计一段与特异性引物R-Primer的5’端Tag序列互补并3’端巯基修饰的序列，记为序列A；合成一段特异性引物R-Primer的5’端Tag序列，记为序列C；

3）将序列T与序列C分别固定于硝酸纤维素膜上，序列A的3’端进行修饰后的序列与胶体金连接，得到金标产物B；

4）提取样品总RNA/基因组DNA，将总RNA通过反转录获得cDNA；将cDNA/基因组DNA样品、特异性引物F-Primer和特异性引物R-Primer置于含有Taq聚合酶的PCR扩增反应体系中进行扩增，得到扩增产物；

5）扩增产物与金标产物B混合后，置于步骤3）已处理的硝酸纤维素膜上进行侧向层析，通过胶体金层析试纸检测扩增产物中是否存在与序列T互补的末端带单链Tag序列的双链DNA，确定待检物是否存目标序列。

作为本发明进一步的方案：所述特异性引物F-Primer和特异性引物R-Primer的5’端分别连接有Tag序列，特异性引物序列与Tag序列通过C9九个碳原子进行连接。 

作为本发明进一步的方案：所述序列A的3’端进行修饰后的序列与胶体金连接是指将序列A的3’端进行巯基修饰后与胶体金颗粒连接，或者序列A的3’端进行biotin修饰，用胶体金颗粒链霉亲和素标记，通过biotin与链霉亲和素结合从而使序列A与胶体金颗粒结合。 

作为本发明进一步的方案：所述步骤4）中采用特异性引物F-Primer和特异性引物R-Primer进行PCR扩增时，Taq聚合酶延伸至C9九个碳原子位点时延伸终止，扩增产物为双向末端带单链Tag序列的双链DNA。 

作为本发明进一步的方案：所述特异性引物序列与Tag序列的连接点可以为任意一种可终止Taq聚合酶延伸的修饰。 

作为本发明再进一步的方案：所述胶体金层析试纸是单链核酸快速检测试纸。 

与现有技术相比，本发明的有益效果是： 

本发明方法操作简便，无需对待测样品进行复杂的前处理，检测成本低，检测结果准确可靠，且本发明可用于所有生物目标序列的检测，通过PCR体系扩增实现待检测物目标序列的定性分析。

附图说明

图1为本发明一种基于PCR的核酸传感器快速检测方法的检测流程图。 

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。 

请参阅图1，一种基于PCR的核酸传感器快速检测方法，包括如下步骤：