[发明专利]一种海洋弧菌褐藻胶裂合酶的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种海洋弧菌褐藻胶裂合酶的纯化方法。具体地，本发明涉及一种从海洋弧菌QY101发酵液中纯化褐藻胶裂合酶的方法。

背景技术

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronateacid，M）及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronateacid，G）通过1，4糖苷键聚合而成的一种酸性多糖，主要存在于褐藻的细胞壁和细胞间质中。褐藻胶一般由三种片段组成：由β-D-甘露糖醛酸构成的均聚物（polyM）；由α-L-古罗糖醛酸构成的均聚物（ployG）；由β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗糖醛酸组成的MG随机交替片段（polyMG）。近年来，褐藻胶寡糖的生物活性不断被发现，如抗氧化、免疫调节、抗病毒、抗心血管疾病、促进植物根生长等，具有广阔的应用前景。褐藻胶裂合酶能以β消除方式降解褐藻胶，在新产生的非还原性末端生成C4,5双键，该结构在230-240nm有强烈的吸收峰。利用褐藻胶裂合酶制备褐藻胶寡糖因反应条件温和可控、对环境友好等特点已逐渐引起人们的关注。现已从细菌、无脊椎动物中分离到数十种褐藻胶裂合酶，但因为酶产量低、分离纯化困难，导致难以大规模应用，大大限制了褐藻胶寡糖的应用与开发。

发明内容

本发明的目的是提供一种从海洋弧菌QY101发酵液中纯化褐藻胶裂合酶的方法。

本发明的褐藻胶裂合酶纯化方法时通过如下技术方案实现的：将海洋弧菌QY101的发酵液3000-12000r/min离心5-30min，弃去沉淀；上清液用截留分子量为50-100kDa的超滤膜进行超滤，去除大分子蛋白，然后把滤出液利用截留分子量为1-10kDa的超滤膜浓缩2-10倍；超滤液上样于离子交换层析柱（DEAESepharoseHighPerformance），按照NaCl浓度进行梯度洗脱，检测收集物中的褐藻胶裂合酶活性。

本发明所用的弧菌QY101发酵液可利用中国发明专利申请03112325.2、201210068851.0提供的方法制备。发酵液体积为0.1-1000L。

本发明的纯化方法可以得到纯度达到75%的褐藻胶裂合酶，回收率达到45%以上，具有工艺简单、容易控制、纯化效果好、回收率高、成本低的优点。

附图说明

图1：纯化后的褐藻胶裂合酶的SDS-PAGE图谱。

具体实施方式

实施例1弧菌QY101发酵液上清的制备

将弧菌QY101发酵所得的发酵液3000-12000r/min离心5-30min，弃去沉淀，保留上清液。

实施例2超滤

上清液用截留分子量为50-100kDa的超滤膜进行超滤，去除大分子蛋白，收集滤出液。然后把滤出液利用截留分子量为1-10kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的液体。浓缩液加入等体积的50mmol/L磷酸盐缓冲液（pH6.5-7.5），再次用截留分子量为1-10kDa的超滤膜浓缩2-10倍，收集被超滤膜截留的液体。

实施例3离子交换层析

以平衡缓冲液(50mmol/L磷酸盐，pH6.5-7.5)平衡DEAESepharoseHighPerformance柱2-10个柱体积，将上步所得浓缩液上样至层析柱。用平衡缓冲液冲洗层析柱，将未结合的蛋白去除。用洗脱缓冲液(0.4MNaCl，50mM的磷酸盐，pH6.5-7.5)洗脱，收集洗脱液。

经过离心、超滤、离子交换层析收集的酶液，进行SDS-PAGE电泳。电泳结果表明纯化后的样品纯度达到75%，回收率达到45.7%。

表1褐藻胶裂合酶纯化总结¹

¹按1L发酵液计算。