[发明专利]新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新城疫弱毒苗纳米粒缓释剂的制备方法。

背景技术

壳聚糖以其独特的结构使壳聚糖及其壳聚糖衍生物在医药、农业、食品及非食品工业方面都有广泛的用途，被认为是一种新型的发挥高超功能的生理学材料所有这些用途源于它们多样的生物学功能特别是生物相容性和完整的降解能力及降解过程中代谢产物极低的毒性。

近年来，对载药可降解生物材料壳聚糖微胶囊的研究取得了重大进展，成为了蛋白类和核酸类等药物递送领域研究的重要发展方向，但此类递送载体仍存在下列问题。壳聚糖的溶解性较差，不溶于水和有机溶剂，仅在稀酸中少量溶解，而在酸性条件制备壳聚糖纳米药物势必对蛋白类和核酸类等药物的生物活性产生影响，这一定程度上限制了纳米药物的产业化制备。因此，对壳聚糖予以改性，改善壳聚糖的水溶性，在适宜(或不影响药物生物活性)条件下制备纳米药物急需研究的课题。壳聚糖是一种亲水性物质，它仅能包裹一些亲水性大分子，而对于疏水性药物，壳聚糖要作为载体还存在难度。

疏水性强的纳米粒易与肠上皮细胞进行生物粘附，而离子化和具有强亲水链表面的纳米粒不易被胃肠道粘膜粘附。疏水性强的纳米粒易于被摄取，因为疏水性纳米粒易于被生物粘附。

发明内容

本发明是要解决现有壳聚糖纳米粒聚合物存在药物包封率低、稳定性差、释药时间短的问题，提供一种新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法。

本发明新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法，按以下步骤进行：

一、O-2′-HACC的合成：

A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成

将3-6g壳聚糖粉末溶于100-200mL体积百分浓度5％～15％的醋酸溶液中，在室温下加入30-80mL无水乙醇，边滴加边搅拌，然后逐滴加入10-20g苯甲醛，30min内加完，边滴加边搅拌，得溶液；向溶液中滴加1.0～2.0mol/L NaOH溶液将溶液调至中性，真空抽滤析出沉淀，然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛，将沉淀于35～50℃烘箱中放置20h，得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖；

B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成

将30-80mL异丙醇和6-18g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵(ETA)混合制成ETA的异丙醇溶液，取1.5-5.6g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中，然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液，在N₂保护条件下于60～85℃水浴搅拌反应12～20h，过滤，依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀，得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖；

C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成

向40-60mL 0.2-0.5mol/L氯化氢乙醇溶液中加入2-5g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖，室温搅拌24h后，减压蒸馏20min，得胶状物；然后向胶状物中加入10-30mL蒸馏水充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，得固体，固体于80℃烘箱中烘干，得浅灰色固状物O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(O-2′-HACC)；

D、样品精制

取O-2′-HACC溶于去离子水中，用足量的丙酮进行沉淀，3G砂芯漏斗抽滤，所得沉淀溶于蒸馏水中，置于透析袋中透析48h，每隔6h更换一次蒸馏水，待浓缩到2mL时，加入足量的丙酮重新沉淀，抽滤，所得固体真空干燥，得到精制的样品O-2′-HACC；

二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备：

a、取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液，然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La Sota株病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

b、溶液A在室温、无菌条件下以900-1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加3.5mL浓度为0.5-3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，再滴加1mL的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，然后滴加1mL的司班-80，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，获得溶液B；

c、将溶液B于4℃、8000-13000r/min离心10-30min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮，获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液；