[发明专利]新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法

权利要求书

1.新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、O-2′-HACC的合成：

A、N-苯亚甲基壳聚糖的合成

将3-6g壳聚糖粉末溶于100-200mL体积百分浓度5％～15％的醋酸溶液中，在室温下加入30-80mL无水乙醇，边滴加边搅拌，然后逐滴加入10-20g苯甲醛，30min内加完，边滴加边搅拌，得溶液；向溶液中滴加1.0～2.0mol/L NaOH溶液将溶液调至中性，真空抽滤析出沉淀，然后用甲醇多次洗涤沉淀除去未反应的苯甲醛，将沉淀于35～50℃烘箱中放置20h，得纤维状浅黄色固体N-苯亚甲基壳聚糖；

B、O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖的合成

将30-80mL异丙醇和6-18g 2,3-环氧丙基三甲基氯化铵混合制成ETA的异丙醇溶液，取1.5-5.6g N-苯亚甲基壳聚糖置于圆底烧瓶中，然后逐滴加入ETA的异丙醇溶液，在N₂保护条件下于60～85℃水浴搅拌反应12～20h，过滤，依次用甲醇和丙酮洗涤沉淀，得乳白色固状物O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖；

C、O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成

向40-60mL 0.2-0.5mol/L氯化氢乙醇溶液中加入2-5g O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖，室温搅拌24h后，减压蒸馏20min，得胶状物；然后向胶状物中加入10-30mL蒸馏水充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，得固体，固体于80℃烘箱中烘干，得浅灰色固状物O-2′-HACC；

D、样品精制

取O-2′-HACC溶于去离子水中，用足量的丙酮进行沉淀，3G砂芯漏斗抽滤，所得沉淀溶于蒸馏水中，置于透析袋中透析48h，每隔6h更换一次蒸馏水，待浓缩到2mL时，加入足量的丙酮重新沉淀，抽滤，所得固体真空干燥，得到精制的样品O-2′-HACC；

二、NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs的制备：

a、取O-2′-HACC溶于去离子水中配制成浓度为0.5-2mg/mL的O-2′-HACC溶液，然后取5mL O-2′-HACC溶液并滴加1.25-7.5mL新城疫La Sota株病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；

b、溶液A在室温、无菌条件下以900-1300r/min磁力搅拌30s，然后滴加3.5mL浓度为0.5-3mg/mL的三聚磷酸钠，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，再滴加1mL的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，然后滴加1mL的司班-80，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5-30min，获得溶液B；

c、将溶液B于4℃、8000-13000r/min离心10-30min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮，获得NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液；

d、在NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液中加入质量浓度为5％的蔗糖脱脂奶，真空冷冻干燥24h，获得新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂。

2.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法，其特征在于步骤一A中壳聚糖的脱乙酰度大于85％。

3.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法，其特征在于步骤二a中新城疫La Sota株病毒液的病毒含量为200μg/mL。

4.根据权利要求1所述的新城疫弱毒苗O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒缓释剂的制备方法，其特征在于步骤二d中NDV/La Sota-O-2′-HACC-NPs悬液与蔗糖脱脂奶的体积比为1∶1。