[发明专利]一种筛选微藻积脂调控酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于微藻生化分析领域，具体涉及一种筛选微藻积脂调控酶的方法。 

背景技术

微藻是极具潜力的生物柴油原料之一。矛盾的是，诸多能源微藻，如褐藻、绿藻、硅藻、盐藻，其油脂积累效率并不理想，致使快速产油无法实现，微藻生物柴油因此成为“贵族”能源。如何提高微藻油脂产率一直是微藻生物柴油产业化的一大难题。目前，获得积脂微藻的培养模式主要包括非生物环境介导的培养模式和与极端环境胁迫耦合的“多阶段”培养模式。 

非生物环境介导的培养模式可诱导藻细胞油脂高效富集，是提高油脂含量的有效途径。华南理工大学吕等通过高盐胁迫极地雪藻获得了较正常条件下高达68倍的油质藻细胞。Takagi等将杜氏盐藻以1M NaCl胁迫诱导，较无盐胁迫条件下藻细胞油脂和甘油三酯含量分别提高70.6％和34.5％，而生物产量仅为0.68g/L。此外，尽管营养限制诱导胞内油脂积累的具体机制尚不明确，但其易控性好，因而对其研究较多。中国农大杨金水课题组、中国科学技术大学储等考察了氮饥饿等特殊环境胁迫微藻积累油脂，成功获得了高油脂含量的藻细胞，有些藻种属油脂含量甚至高达80％。但是，尽管非生物逆境在油脂积累过程中起正调控作用，却也限制了细胞生长，影响总脂产量，无法满足微藻油脂作为理想生物柴油原料的要求。 

与极端环境胁迫耦合的“多阶段”培养模式可从整体上优化油脂产量。华东理工大学李元广课题组的“异养-稀释-光诱导”多阶段培养模式使得微藻油脂产率高达89.89mg/L/d。尽管“多阶段”培养模式能显著提高微藻油脂产率，但与 Sheehan等提出的油脂产量最大理论值相比，尚存在较大差距。部分原因在于缺乏对能源微藻胞内油脂代谢与环境互作调控机制的认识。 

关于藻类油脂合成代谢研究相对较少，目前所掌握的成果也是基于对高等植物以及有限的藻种的研究。中科院袁振宏课题组、亚利桑那州立大学Li等研究发现氮饥饿、高光诱导等条件下微藻细胞内的淀粉、叶绿素、蛋白质等能量物质经一系列代谢途径转化为油脂存储。美国内布拉斯加林肯大学Msanne等通过氮限制刺激诱导莱茵衣藻胞内油脂积累，当油脂含量增加时，叶绿素和蛋白质含量降低，包括一些核糖体多肽和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶均降低，说明叶绿素和蛋白质也可提供油脂合成所需碳和能量，这与布鲁克黑文国家实验室Fan等的研究结果一致。暗示微藻油脂富集与它种能量物质之间存在一定的代谢动态关系。中科院李等采用抑制消减杂交技术通过cDNA文库筛选得到了响应氮饥饿胁迫积累油脂相关的上调和下调基因，通过其潜在的分子路径得出醛糖异构酶、淀粉磷酸化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、二氢硫辛酰胺脱氢酶、甘油二酯激酶是微藻细胞油脂合成代谢途径关键调控酶，分别参与糖酵解、丙酮酸和乙酰CoA生成、TAG合成代谢途径，丙酮酸和乙酰CoA是整个代谢网络的关键调控点，通过调控酶的表达水平证实油脂合成是由淀粉经糖酵解转化而来。尽管植物细胞中调控油脂合成的酶可为藻细胞所借鉴，但藻细胞内调控油脂合成的关键酶特性不同于植物细胞，且植物或者微生物细胞油脂合成过程关键调控酶并非微藻细胞油脂合成的限速酶。例如，将调控酵母或者大肠杆菌油脂合成的乙酰辅酶A羧化酶于藻细胞内过高表达，并未导致油脂含量显著的提高。与此同时，传统筛选积脂标志物的方法为“一个藻株，两个反差条件”，即通过对同种藻株施以两种极端环境条件胁迫(如：高盐胁迫与无盐胁迫，氮富足与氮饥饿)来发现和鉴定油脂代谢调控点，该方法所甄选的油脂代谢调控酶 因藻种属差异而不具普适性与指导意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选微藻积脂调控酶的方法。 

本发明的技术方案为： 

一种筛选微藻积脂调控酶的方法，包括如下步骤：(1)建立实验室人工模拟下的盐环境，培养盐敏感小球藻及耐盐小球藻；(2)藻细胞全蛋白的荧光差异凝胶电泳蛋白组学分析；(3)藻细胞积脂关键调控酶的甄选与鉴定。 

上述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述实验室人工模拟的盐环境具体为：向基础培养基中加入NaCl，使氯化钠的质量分数达到3.5％(海水盐浓度)，经灭菌、冷却后，按培养基体积的1-10％接入藻细胞种子液，然后在28℃条件下培养12-72小时。 

上述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述盐敏感小球藻为普通淡水小球藻，所述耐盐小球藻为海水小球藻。