[发明专利]一种筛选微藻积脂调控酶的方法

权利要求书

1.一种筛选微藻积脂调控酶的方法，包括如下步骤：(1)建立实验室人工模拟下的盐环境，培养盐敏感小球藻及耐盐小球藻；(2)藻细胞全蛋白的荧光差异凝胶电泳蛋白组学分析；(3)藻细胞积脂关键调控酶的甄选与鉴定。

2.根据权利要求1所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述实验室人工模拟的盐环境具体为：向基础培养基中加入NaCl，使氯化钠的质量分数达到3.5％，经灭菌、冷却后，按培养基体积的1-10％接入藻细胞种子液，然后在28℃条件下培养12-72小时。

3.根据权利要求1所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述的盐敏感小球藻为普通淡水小球藻，所述的耐盐小球藻为海水小球藻。

4.根据权利要求1所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述的基础培养基具体为：按质量份数计，Glucose10份、KH₂PO₄1.25份、Urea3份、MgSO₄·7H₂O1份、Na₂EDTA0.5份、H₃BO₃0.12份、CaCl₂0.84份、ZnSO₄·7H₂O0.88份、MnCl₂·4H₂O0.014份、Na₂ΜoO₄0.007份、CuSO₄·5H₂O0.016份、Co(NO₃)₂·6H₂O0.005份、FeSO₄·7H₂O0.05份、蒸馏水1000份，培养基pH6.1，115℃灭菌20min。

5.根据权利要求1所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述的藻细胞全蛋白的荧光差异凝胶电泳蛋白组学分析具体为：(a)藻细胞全蛋白提取、纯化与定量：离心收集藻细胞团进行裂解、超声处理，然后破碎核酸，离心收集上清液蛋白，经纯化、过夜沉淀、自然干燥后获得纯蛋白质团块，团块重溶后以紫外分光光度法测定其浓度；(b)蛋白质荧光差异凝胶二维电泳分析：蛋白样品经pH调试、染色、一维等电聚焦、二维双向SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝胶电泳)后，获得蛋白凝胶片；(c)凝胶图谱差异蛋白点分析：蛋白凝胶片经扫描成像，然后采用计算机图谱数字分析化法分析2D凝胶图谱包括蛋白质点的检测、背景消除和点的匹配、蛋白点匹配和体积计算，筛选重复性高、差异表达2.5倍以上的蛋白质点或者新诱导、消失的有意义蛋白点；(d)差异蛋白质谱鉴定：差异蛋白经切胶、胶内酶解、点靶上机、质谱分析获得肽质量指纹图谱，再进行数据库检索：利用软件flex Analysis过滤基线峰、识别信号峰，再利用MASCOT程序和搜索引擎实施NCBInr、SWISS-PROT及TrEMBL蛋白数据库检索，寻找匹配蛋白，查询其功能，明确蛋白身份。

6.根据权利要求5所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述的数据库检索条件为：1)肽质量范围：800-4000Da；2)表观pI与表观Mr的误差范围：无限制；3)一级质谱质量误差范围：50ppm；4)二级质谱质量误差范围：0.6Da；5)酶解片段不完全即遗漏酶切位点:1个；6)物种来源:Chlorella vulgaris；7)电荷：+1；8)同位素峰：monoisotopic；9)固定修饰：半胱氨酸碘乙酰胺化；10)可变修饰：蛋氨酸氧化。

7.根据权利要求1所述的筛选微藻积脂调控酶的方法，所述的藻细胞积脂关键调控酶的甄选与鉴定具体为：

将差异蛋白质转换成相应的NCBI-gi登录号即不同组别差异蛋白登录号，输入http://www.pir.georgetown.edu/pirwww/search/batch.shtml网站，按照相关操作，采用GO富集分析差异表达蛋白质的亚细胞位置包括细胞质、细胞核和细胞膜的定位及生物学功能；

采用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes即KEGG数据库分析差异蛋白在生物体内所参与的生物通道，确保每个生物通路中至少含有3个差异蛋白。登录网站http://www.genome.jp，选择物种Chlorella vulgaris，选择物种登录号种类NCBI-gi，进行具体通路分析；若KEGG数据库网站没有Chlorella vulgaris，则选择该网站与之相近物种数据，将Chlorella vulgaris差异蛋白登录号匹配成与之相近物种蛋白登录号，以％identity和％positives两种参数衡量匹配度，选择匹配相识度高大于80％的匹配登录号进行差异表达蛋白的KEGG代谢通路分析，从而甄选与鉴定出油脂合成关键调控酶。