[发明专利]细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学领域，是一种针对少量细胞的胞内氨基酸代谢轮 廓高通量分析方法。

背景技术

在系统生物学的理论框架下，借助代谢轮廓分析，将代谢表型及代谢 通路的扰动与其内在的病理生理机制联系起来的“多组学”研究已越来越多 地被用于癌症研究,干细胞和药效及药物毒理研究中。细胞代谢轮廓分析是 实现上述研究目的的重要工具。在细胞代谢轮廓分析中，细胞培养耗时多、 预处理步骤繁杂等一直是限制分析通量提高的主要因素。利用96孔组织培 养板可以实现少量细胞(约10³-10⁴个)的快速培养及高通量操作。此外， 在干细胞的研究中，可用于代谢轮廓分析的干细胞数目相对较少，常规的 分析策略难以获得丰富的代谢组数据。因此，实现少量细胞的代谢轮廓分 析方法具有重要意义。

虽然UPLC-MS分析灵敏度有了很大提高，但目前在检测胞内代谢组时 常需要大量细胞(>10⁶cells)。由于代谢物种类繁多、结构多样，在少量 细胞中代谢物整体含量较低，因此在代谢物分析的覆盖率及灵敏度之间需 要一个合适的平衡点。因此，我们采用了“分而治之”的策略，即针对不同类 代谢物分别采用不同的预处理方法，提高其检测灵敏度，实现对特定代谢 通路的覆盖。氨基酸在细胞中具有非常重要的功能，既是蛋白质的基本组 成单元，也是重要的代谢调节分子。如谷氨酰胺是某些癌细胞的必需氨基 酸，同时也用于维持三羧酸循环。同时，氨基酸可以通过代谢回补通路来 进出三羧酸循环，从而参与糖和脂类代谢，因而氨基酸代谢轮廓可以部分 反映中心碳代谢对内外源干预的响应。

我们选择针对96孔板培养的细胞为研究对象，并首先以检测胞内氨基 酸为目标来研发高通量、高灵敏的96孔板细胞胞内代谢轮廓分析方法。提 出的具体实验方案包括从细胞预处理到LC-MS分析的全部流程。通过开发 简便的细胞淬灭提取程序，可以在简化预处理步骤的同时，提高提取的重 复性。选用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对氨基酸进行化学修饰，可以增加 极性较高的氨基酸类、其他含氨基或酚羟基化合物在液相上的保留，减少 离子抑制，改善分析精度，提高其检测灵敏度。

针对96孔板接种培养的细胞的胞内氨基酸类代谢轮廓分析，我们开发 了简便的细胞淬灭提取程序，同时结合丹酰化修饰来提高氨基酸的分析灵 敏度，该方法可以实现对96孔板接种培养的10³-10⁴个细胞的胞内代谢物的 高灵敏度、高通量检测。这一结果突破了目前胞内代谢物检测中需要10⁶-10⁷ 量级细胞的限制，可用于高通量的代谢物功能阐释，还可用于新药快速筛 选，及无法获得大量细胞的干细胞等相关研究中。我们将这一方法初步应 用于脂肪酸对HepG2细胞的干预实验中，验证了其实用性。

发明内容

本发明的目的在于建立一种针对96孔组织培养板上生长的细胞胞内代 谢轮廓分析方法，实现在少量细胞基础上的高灵敏、高通量的代谢轮廓分 析，同时该方法也具有代谢淬灭和代谢物提取简便的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

(1)96孔组织培养板中生长的细胞用冷PBS清洗后，利用冷甲醇/水对 细胞进行代谢淬灭和代谢物静置提取。样品淬灭、提取一步完成，预处理 过程简单，无须冻融、超声等细胞破碎过程；

(2)上清液或滤液用丹磺酰氯进行衍生，离心或过滤后上清用于上样 分析。采用短柱分析，并优化分离检测条件，可实现10³-10⁴个细胞的胞内 氨基酸及更多含氨基及酚羟基化合物的轮廓分析。

具体步骤如下(图1)：

(1)在96孔组织培养板中生长的细胞，先用150-250μL0-4℃PBS快速 洗涤培养于96孔板每一孔中的细胞三次。(2)然后于96孔板每一孔中迅 速加入30-50μL淬灭溶液(0-4℃，含30-60％甲醇的水溶液，其中含浓 度为0.1-2.5μg/mL同位素内标Ala-d⁴,Val-d⁸和Trp-d⁵)进行细胞代谢淬 灭；继而在4℃下静置提取30-60min.(3)将96孔板每一孔中提取液离心 或用96孔过滤板过滤后，取40-70μL上清或滤液用于衍生。