[发明专利]细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法

权利要求书

1.细胞胞内氨基酸代谢轮廓分析方法，所述方法包括：

(a)取洗去培养基的细胞，利用冷甲醇水溶液对细胞进行代谢淬灭和低 温静置提取，离心或过滤，得细胞胞内代谢物提取液；

(b)采用丹磺酰氯作为衍生化试剂，对提取液中含氨基及酚羟基代谢 物进行衍生，终止衍生后，离心或过滤，收集衍生后的溶液；

(c)采用液相色谱-质谱联用的方法，在正离子模式下对衍生后溶液中的 细胞胞内代谢物进行检测。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：步骤(c)采用高效液相色谱- 质谱法进行代谢轮廓分析；

以PBS清洗去除培养基后的细胞，得洗去培养基的细胞；PBS为预冷至 0-4℃的PBS缓冲盐溶液。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：冷甲醇水溶液为预冷至 0-4℃，体积含量30-60％甲醇的水溶液，甲醇的水溶液中还含有同位素内标， 同位素内标分别为浓度0.1-2.5μg/mL的Ala-d⁴、Val-d⁸和Trp-d⁵；

采用冷甲醇水溶液对细胞淬灭后，进行低温静置代谢物提取，提取条 件为：细胞淬灭后的混合液静置于0-4℃环境下30-60分钟。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于：用于细胞代谢物衍生的试 剂包括：缓冲盐溶液，衍生化试剂以及终止衍生化反应试剂；终止衍生后， 离心或过滤，收集衍生后的溶液；

所述缓冲盐溶液指的是0.1-0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液；

采用0.5-5mg/mL丹磺酰氯的乙腈溶液作为衍生化试剂；

缓冲盐溶液、衍生化试剂和提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应温度 为50-70℃,反应时间为40-60min。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：

以d⁶-丹磺酰氯作为参照衍生化试剂，进行辅助鉴定；用于细胞代谢物 辅助衍生的试剂包括：缓冲盐溶液，参照衍生化试剂以及终止衍生化反应 试剂；终止衍生后，离心或过滤，收集辅助衍生后的溶液；

所述缓冲盐溶液指的是0.1-0.5M碳酸钠/碳酸氢钠缓冲盐溶液；

即采用0.5-5mg/mLd⁶-丹磺酰氯的乙腈溶液作为辅助衍生化试剂，对 提取液中含氨基及酚羟基代谢物进行辅助衍生化；

缓冲盐溶液、附助衍生化试剂与提取液的体积比为1:1:1，衍生化反应 温度为50-70℃,反应时间为40-60min。

6.根据权利要求1、3或4所述方法，其特征在于：所述终止衍生化反 应试剂指的是50-500μM丁胺水溶液，于每150μL衍生体系或辅助衍生体 系中终止衍生化反应试剂加入量为20-40μL。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于：辅助鉴定时，将辅助衍生 后的溶液与衍生后的溶液按等体积混合后再进行步骤(c)的检测分析过程。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：

所测标本为细胞，步骤(a)所取细胞数量在10³-10⁴之间。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：经衍生的含氨基及酚羟基 代谢物，在正离子模式下，形成质荷比为M(分子量)+234.059，M+307.148。

10.根据权利要求1或8所述方法，其特征在于：所测标本为96孔板培 养的细胞，96孔板每一孔中培养的细胞为一个独立的分析样本。