[发明专利]APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫病分子生物学检验方法及检验试剂领域，具体涉及猪传染性胸膜肺炎放线杆菌APP、猪肺炎支原体M.hyo、圆环病毒2型PCV-2及猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV多重PCR检测用检测用引物、试剂盒和检测方法。

背景技术

猪呼吸道疾病综合征（PRDC）就是由病毒、细菌、支原体、寄生虫、环境因素、断奶转群应激和猪体免疫力低下等多种因素引起的猪呼吸道疾病的总称。临床表现为发热、咳嗽、气喘、呼吸困难、腹式呼吸、眼鼻分泌物增多、厌食、迅速消瘦、被毛粗乱，可发生突然死亡。该病发病率可达60%，病死率为20%-90%。在仔猪断奶后，特别是18-20周龄的育成猪，临床症状尤为明显，对猪群危害十分严重。该病已成为影响全球养猪业的重大疾病之一,近几年在我国部分地区的猪场也迅速蔓延开来，严重制约着我国养猪业的健康发展。其中，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒等均为常见的PRDC原发性病原体，临床症状极为相似难以区分，而且往往表现为混合感染。目前，现有的检测APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV的方法主要依靠病理解剖、病原菌分离、血清学方法等传统的方法，其操作繁杂、费时费力、敏感性低，难以直接分辨出APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV四种病菌。因此，急需建立一种快速、敏感、方便的特异性检测方法应对日趋复杂的猪混合病原体感染的检测。多重PCR 是一种利用多条特异性引物在同一PCR反应体系中同时扩增出多个核酸片段的方法，具有操作简单、快速、特异性和敏感性高等优点，并在动物病原检测中被广泛应用。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一套猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒四重PCR检测的引物以及试剂盒。第二个目的是提供使用该引物用于猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的四重PCR检测的方法。

为了实现上述第一目的本发明采用如下技术方案：根据GenBank 发表的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的保守基因核苷酸序列，用软件Primer Primer 5.0软件设计引物并进行BLAST序列比对初步验证引物特异性，其引物如下：

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性上游引物，其DNA序列为APP SEQ NO.1；

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性下游引物，其DNA序列为APP SEQ NO.2；

猪肺炎支原体的PCR特异性上游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ NO.3；

猪肺炎支原体的PCR特异性下游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ NO.4；

猪圆环病毒2 型的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ NO.5；

猪圆环病毒2 型的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ NO.6；

猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ NO.7；

猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ NO.8。

本发明提供的PCR检测用试剂盒包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为APP SEQ NO.1 的20μmol/L的APP上游引物0.25μL；

DNA序列为APP SEQ NO.2 的20μmol/L的APP下游引物0.25μL；

DNA序列为M.hyo SEQ NO.3 的20μmol/L的M.hyo上游引物0.25μL；

DNA序列为M.hyo SEQ NO.4 的20μmol/L的M.hyo下游引物0.25μL；

DNA序列为PCV-2 SEQ NO.5 的20μmol/L的PCV-2上游引物0.25μL；

DNA序列为PCV-2 SEQ NO.6 的20μmol/L的PCV-2下游引物0.25μL；

DNA序列为PRRSV SEQ NO.7 的20μmol/L的PRRSV上游引物0.25μL；

DNA序列为PRRSV SEQ NO.8 的20μmol/L的PRRSV下游引物0.25μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 12.5μL；

灭菌去离子水 9.5μL；