[发明专利]APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物、试剂盒和检测方法

权利要求书

1. APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用引物，其特征在于：包括

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性上游引物，其DNA序列为APP SEQ NO.1；

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的PCR特异性下游引物，其DNA序列为APP SEQ NO.2；

猪肺炎支原体的PCR特异性上游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ NO.3；

猪肺炎支原体的PCR特异性下游引物，其DNA序列为M.hyo SEQ NO.4；

猪圆环病毒2 型的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ NO.5；

猪圆环病毒2 型的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PCV-2 SEQ NO.6；

猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性上游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ NO.7；

猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR特异性下游引物，其DNA序列为PRRSV SEQ NO.8。

2.APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用试剂盒，其特征在于：包括扩增反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，所述扩增反应液管，管内由以下反应液组成：

DNA序列为APP SEQ NO.1 的20μmol/L的APP上游引物0.25μL；

DNA序列为APP SEQ NO.2 的20μmol/L的APP下游引物0.25μL；

DNA序列为M.hyo SEQ NO.3 的20μmol/L的M.hyo上游引物0.25μL；

DNA序列为M.hyo SEQ NO.4 的20μmol/L的M.hyo下游引物0.25μL；

DNA序列为PCV-2 SEQ NO.5 的20μmol/L的PCV-2上游引物0.25μL；

DNA序列为PCV-2 SEQ NO.6 的20μmol/L的PCV-2下游引物0.25μL；

DNA序列为PRRSV SEQ NO.7 的20μmol/L的PRRSV上游引物0.25μL；

DNA序列为PRRSV SEQ NO.8 的20μmol/L的PRRSV下游引物0.25μL；

2×Premix Ex Taq缓冲液 12.5μL；

灭菌去离子水 9.5μL；

合计24μL，为单次反应的用量；

所述阳性对照管，管内为阳性猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、阳性猪肺炎支原体、阳性猪圆环病毒2 型及阳性猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组质粒DNA，体积为20μL；

所述阴性对照管，管内为无猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的猪组织基因组DNA，体积为20μL；

所述灭菌去离子水管 1mL～2mL。

3.根据权利要求书2所述APP、M.hyo、PCV-2及PRRSV多重PCR检测用试剂盒，其特征在于：所述阳性对照管内的重组质粒DNA由如下反应获得：分别以如下引物组APP SEQ NO.1和APP SEQ NO.2，M.hyo SEQ NO.3和M.hyo SEQ NO.4，PCV-2 SEQ NO.5和PCV-2 SEQ NO.6，PRRSV SEQ NO.7和PRRSV SEQ NO.8，按常规方法进行PCR扩增，分别将PCR扩增产物与pMD19-T载体进行连接反应获得所述阳性重组质粒DNA。

4.利用权利要求2或3所述试剂盒进行猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重PCR非疾病检测目的的检测方法：包括如下步骤：

1）制备待检模板DNA：选用商品化的细胞培养液DNA提取试剂盒，提取待测样品中DNA，获得待检模板DNA；

2）扩增反应体系为：24μL扩增反应液；1μL待检模板DNA或阳性对照或阴性对照；反应体系的总体积为25μL;

3）多重PCR扩增：将步骤2）配制好的扩增反应体系进行PCR扩增，反应条件：预变性94.0℃ 5 min；94.0 ℃ 变性30 s，58.0℃～61.0℃ 退火 30 s，72.0 ℃ 延伸 30 s，35个循环；72.0 ℃ 延伸7min；4.0 ℃保存；

4）结果判定：2%琼脂糖凝胶结果判定，猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2 型及猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性分别在107bp、176bp、337bp及225bp处出现特异性扩增条带。